重组腺病毒介导MRP反义RNA对人肝癌耐药细胞株MDR表型逆转的实验研究

摘要

目的探讨重组腺病毒载体介导的多药耐药相关蛋白(M RP)反义RNA对多柔比星(阿霉素)诱导的人肝癌耐药细胞株SMM C-7721/ADM多药耐药表型的逆转作用。方法将M RP基因5′端转录起始位点附近长约500 bp的基因片段反向克隆到腺病毒A dE asy系统的穿梭质粒A dT rack-CM V上,通过在细菌内同源重组、并在293细胞中包装、扩增,构建出携带反义M RP的重组腺病毒A dE asy-GFP-A sm rp(简称A d-A sm rp),测定其滴度及对肝癌细胞SMM C-7721/ADM的转染效率;在体外用M O I为100的该重组腺病毒转染肝癌细胞SMM C-7721/ADM,测定转染后细胞对阿霉素(ADM)及柔红霉素(DNR)的半数致死量(IC50)并计算耐药倍数(RF值);在转染后不同时间点(24、48、72、96、120小时)用流式细胞仪动态测定细胞对DNR摄取的变化及细胞膜表面P190表达、并用RT-PCR反映细胞M RP之mRNA水平的变化(以βactin mRNA水平为内对照)。结果重组腺病毒A d-A Sm rp滴度可达2.5×109efu/m l,M O I为100时,即可致90%以上的肝癌细胞SMM C-7721/ADM被感染。体外实验中,该重组腺病毒(M O I=100)转染后的人肝癌耐药细胞SMM C-7721/ADM对ADM、DNR的IC50分别为0.487μg/m l、0.328μg/m l,RF分别为97.4倍、109.3倍,RF分别下降36.8倍和35.4倍。在转染后24小时,M RP之mRNA水平开始下降并呈持续下降趋势(P<0.05),48小时后伴有P190蛋白表达的持续下降(P<0.05),二者趋势一致。转染后48小时,经流式细胞仪测得细胞内DNR浓度出现上升趋势(P<0.05),此后持续明显上升(P<0.05)。结论重组腺病毒介导的M RP反义RNA可有效封闭M RP基因表达,降低P190蛋白水平,在体外实验中能增加人肝癌耐药细胞株SMM C-7721/ADM对化疗药物的敏感性,对肝癌耐药细胞的M DR表型有较好的逆转作用,并为肝癌M DR机制及其逆转方式的研究提供实验基础。