Bradford定量法在蛋白质组学中应用的优化研究

摘要

Bradford法具有成本低、灵敏度高和测定快速简便的特点,是目前应用最广泛的蛋白质定量方法之一.为使Bradford法更适合在蛋白质组学研究中应用,针对双向电泳样品对经典Bradford法进行了优化.通过分析0～1000μg范围内蛋白质含量与吸光度的关系,确定Bradford法的线性范围在0～100μg之间.通过分析不同体积蛋白质裂解液(lysis)、lysis各组分以及不同表面活性剂的干扰程度,发现lysis的干扰程度与其体积呈正相关;通过在有无lysis两种条件下连续测定蛋白质样品吸光度的变化,发现lysis会降低蛋白质-染料复合物的稳定性,较适宜的测定时间为反应后3～30 min;将显色液中磷酸含量提高至10.2％(w/V)可提高蛋白质-染料复合物的稳定性.由于相同含量蛋白质样品在有无lysis两种条件下,吸光度值有较大差异,因此在制作标准曲线时,在标准蛋白样品和对照中都应加入相应体积的lysis.通过将加样体积从100μL减小为10μL并比较不同加样体积所得标准曲线,发现加样体积调整可减小数据波动性,改善标准曲线线性关系,同时可省去对样品的稀释步骤,简化操作.