一种靶向Wee1蛋白激酶的小分子抑制剂体外筛选模型的建立

摘要

目的建立靶向Wee1激酶的小分子抑制剂体外筛选模型,为Wee1抑制剂的筛选提供评价方法。方法使用ADP-Glo法检测Wee1的激酶活性;在p53突变型人结直肠癌细胞(WiDr)上优化了损伤剂的作用时间与浓度以及Wee1抑制剂的作用时间,建立了评价Wee1抑制剂MK-1775单用以及与化疗药物吉西他滨联用的细胞活性评价模型;使用Odyssey in-cell Western方法检测细胞内Wee1的下游蛋白Cdc2及HH3的磷酸化水平,在细胞水平验证Wee1抑制剂的作用机制。结果优化了DNA损伤剂吉西他滨的作用浓度(4.5 nmol/L)与作用时间(48 h)以及Wee1抑制剂MK-1775的作用时间(72h)。使用MK-1775对筛选模型进行验证,吉西他滨或MK-1775单用对细胞均表现出较弱的增殖抑制作用,而在联用实验中,MK-1775能明显增加吉西他滨对细胞的损伤作用,且3次重复实验结果稳定。结论成功建立了一种简单、新颖、有效的Wee1激酶小分子抑制剂体外筛选模型。