超声靶向微泡破坏联合经典核定位信号肽促进基因转染的实验研究

摘要

目的利用超声靶向微泡破坏（UTMD）技术联合经典核定位信号肽（cNLS）促进目的基因入核,提高转染效率。方法用不同的方式将增强型绿色荧光蛋白质粒（pEGFP）转入293T细胞。实验分4组:UTMD+pEGFP（对照组）,UTMD+pEGFP+cNLS（经典型组）,UTMD+pEGFP+mNLS（突变型组）和UTMD+pEGFP+cNLS+WGA（入核阻滞组）。NLS和pEGFP分别用FITC和Cy3标记。转染6 h后,流式细胞仪检测Cy3阳性细胞百分比作为质粒入胞率,激光共聚焦显微镜观测细胞核中Cy3荧光强度占整个细胞荧光强度百分比作为质粒的入核率。转染48 h后,用流式细胞仪检测转染效率,CCK8检测细胞存活率,RT-PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白的相对表达量,并比较上述指标在4组间的差异以评价cNLS在UTMD介导基因转染中的作用。结果①转染6 h后,带绿色荧光标记的NLS在细胞内不同部位显示,经典型组大量入核,突变组细胞质和细胞核均可显示,入核阻滞组主要聚集在细胞质,未能入核;②转染6 h后,4组质粒的入胞率分别为（61±11）%、（80±10）%、（55±9）%和（58±10）%;入核率分别为（20±4）%、（50±11）%、（18±3）%和（10±3）%,经典组入核率和入胞率最高,入核阻滞组最低,差异有统计学意义（P＜0.05）。③转染48 h后,4组细胞活性均＞80%;转染效率、mRNA和蛋白相对表达量均在经典组最高,入核阻滞组最低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 UTMD联合cNLS能提高pEGFP入核率,从而提高目的基因转染效率。