基于超支化聚酰胺胺可生物降解阳离子基因递送系统的构建与体外评价

摘要

背景:与其他聚阳离子相比,超支化聚酰胺胺的细胞毒性小、生物相容性好、溶血活性低、易于表面修饰,在基因递送中是一类具有广阔应用前景的阳离子聚合物。但目前应用于基因转染的超支化聚酰胺胺大多不可降解,易在体内聚集引起细胞毒性。目的:合成还原降解超支化聚酰胺胺(redox-degradable hyperbranched polyamidoamine,DHPAA),考察其作为基因递送载体的安全性和有效性。方法:以N,N''''-双(丙烯酰)胱胺(BAC)和1-(2-氨乙基)哌嗪(AEPZ)为功能性单体,通过迈克尔加成一锅法合成DHPAA,采用核磁共振氢谱、凝胶渗透色谱和酸碱滴定法对其结构和性能进行表征。采用自组装法制备DHPAA/DNA复合物,使二者质量比分别为1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1;采用动态光散射和透射电镜测定复合物的粒径、形貌和Zeta电势;采用琼脂糖凝胶阻滞电泳、Picogreen荧光分析和体外释放DNA实验检测DHPAA对DNA的固缩能力及DHPAA的还原降解性。以人肾上皮细胞系HEK293、人乳腺癌细胞系MCF-7、间充质干细胞和子宫颈癌细胞系Hela为细胞模型,采用MTT法检测聚合物DHPAA的细胞毒性;以间充质干细胞和子宫颈癌细胞系Hela为细胞模型,采用MTT法检测DHPAA/DNA复合物的细胞毒性。以绿色荧光蛋白报告基因为研究对象(绿色荧光蛋白报告基因与DHPAA的质量比分别为1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1),使用流式细胞仪与共聚焦激光扫描显微镜考察DHPAA在间充质干细胞中的体外转染效率。结果与结论:①合成的聚合物DHPAA结构符合分子设计,在pH=3-10范围内具有良好的缓冲能力;聚合物DHPAA对DNA分子具有很好的固缩能力,形成的复合物在生理条件下很稳定,在还原性介质中能够快速释放出DNA;当DHPAA/DNA质量比由1∶1增加到10∶1时,复合物的包封率逐渐增加,此后质量比继续增加包封率不再增加;②在1-200mg/L范围内,聚合物DHPAA对HEK293、MCF-7、间充质干细胞和Hela细胞的存活率无影响;③当质量比由1∶1增加到10∶1时,25mg/LDHPAA/DNA复合物对间充质干细胞和Hela细胞的存活率无影响;④当质量比由1∶1增加到10∶1时,DHPAA/绿色荧光蛋白报告基因复合物的转染效率逐渐增加,当质量比继续增加时转染效率增加缓慢;⑤结果表明,还原降解DHPAA生物相容性好,能够高效地将基因递送到细胞内并高效表达基因。综合考虑DHPAA的DNA负载效率和复合物的转染效果,选择10∶1为最佳聚合物/DNA质量比。