猪链球菌3种毒力因子多细胞表位靶向DC重组蛋白DC3pep-SDZ的构建及安全性检测

摘要

为了研制2、3、9型猪链球菌(SS)通用的重组亚单位疫苗,本研究通过生物信息学软件对SS分泌型核酸酶A(SsnA)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLDH)、锌转运蛋白(ZnuA)3种毒力因子的蛋白质一级结构、B细胞及辅助T(Th)细胞抗原表位、亲疏水性及抗原性、二级结构进行综合分析后,预测获得了SsnA、DLDH和ZnuA具有亲水性和较好抗原性的B/Th细胞表位,将它们与12聚体树突状细胞靶向肽(DC3pep)序列串联后获得了重组氨基酸序列DC3pep-SDZ。经蛋白质理化分析DC3pep-SDZ分子质量约为44 ku,理论等电点(pI)为4.65,平均亲水性为-0.462,为亲水性蛋白。由生物公司构建重组原核表达载体pET28a-DC3pepSDZ,转化感受态细胞后经IPTG诱导表达后经western blot鉴定重组蛋白以可溶形式表达。表达产物利用亲和层析镍柱纯化,SDS-PAGE结果显示得到44 ku的纯化目的蛋白,纯化浓缩后经BCA蛋白浓度测定试剂盒检测,浓度为5.60 mg/mL。利用不同浓度纯化重组蛋白对2%猪红细胞悬液进行体外溶血试验,并对PK15、IPEC-J2细胞进行毒性试验,检测重组蛋白的生物安全性。体外溶血试验结果显示在5μg/mL~500μg/mL浓度范围内,DC3pep-SDZ蛋白对2%猪红细胞悬液溶血率低于5%;细胞毒性试验结果显示经500μg/mL DC3pep-SDZ蛋白孵育后,PK15与IPEC-J2细胞的相对增殖率(RGR)分别为98.5%和99.6%,与对照组RGR相比均无显著差异。表明,重组蛋白无明显毒性作用。本实验首次构建并表达了重组蛋白DC3pep-SDZ,该蛋白生物安全性良好,为后续分析其免疫保护效果、研发2、3、9型SS重组亚单位疫苗奠定基础。