同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

摘要

为建立可以同时检测多杀性巴氏杆菌(Pm)及其荚膜A型的快速敏感检测方法,本研究在建立的Pm kmt 1基因的荧光定量PCR基础上,设计了该菌capA基因特异性引物和TaqMan探针,经优化反应条件建立了双重TaqMan荧光定量PCR检测方法.本实验从荚膜A型Pm C48-1菌株中扩增了 capA基因,构建了重组质粒pMD-capA;以pMD-capA重组质粒为标准品,建立的标准曲线在9.83x 103拷贝/μL～9.83×109拷贝/μL内与Ct值具有良好的线性关系,相关系数(R2)为0.9873,扩增效率(E)为1.032.建立的双重荧光定量PCR方法可以同时检测Pm及其荚膜A型,而对B型、D型Pm、鸭疫里默氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等细菌检测结果均为阴性,具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测灵敏度为101拷贝/μL,高于常规PCR检测方法(103拷贝/μL)100倍具有较高的敏感性;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2％,具有较好的重复性.本实验建立的双重荧光定量PCR方法可以同时快速敏感地检测Pm及其荚膜A型,对于其临床和实验室的快速诊断具有重要意义.