单核细胞增生李斯特菌核糖核酸酶RNase Ⅲ RncS的表达及其生物学活性研究

摘要

为了解单增李斯特菌(LM)核糖核酸酶RNaseⅢ RncS的生物学活性,本研究通过PCR方法对该菌LM-SB5野毒株中编码RNaseⅢ的rncS基因进行扩增、克隆及测序并对其进行生物信息学分析;将rncS基因克隆至表达载体pET-32a(+),转化至大肠杆菌中进行诱导表达.通过体外酶活实验研究目的蛋白对RNA的降解活性.序列分析结果显示,rncS基因全长690bp,编码229个氨基酸;生物信息学分析结果显示,该基因编码的蛋白含有由9个保守氨基酸(ERLEFLGDA)组成的基序,2个N-酰基化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点,提示该酶蛋白活性受磷酸化的调控.同源性分析显示,LM-SB5 rncS基因编码的蛋白氨基酸序列与LM标准株CAC99883.1的同源性为99.13％.SDS-PAGE检测结果显示,表达的RncS蛋白相对分子量约为42.5 ku,与理论值相符;western blot分析表明重组RncS蛋白具有较强的反应原性.体外酶活实验表明,RncS是一种依赖于二价金属离子的核酸酶,且二价金属离子浓度不同其RNaseⅢ的切割活性则不同.本研究为进一步研究RncS在LM中调控ncRNAs的分子机制奠定前期基础.