两种胚胎干细胞实验模型评价邻苯二甲酸（2-乙基己基）酯胚胎发育毒性的比较研究

摘要

目的建立并应用小鼠胚胎干细胞实验（mEST）模型与人胚胎干细胞实验（hEST）模型评价邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）的胚胎发育毒性。方法参照欧洲替代方法研究中心（ECVAM）的标准操作方法,建立mEST、hEST模型,并选用ECVAM推荐的已知强胚胎发育毒性物质5-氟尿嘧啶（5-FU）和无胚胎毒性物质青霉素G（PN-G）进行模型验证,在模型验证有效的基础上,以15.6、31.2、62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0μg/ml浓度的DEHP分别染毒小鼠胚胎干细胞D3（mESC-D3）、Balb/c小鼠成纤维细胞3T3（3T3）及人胚胎干细胞H9（hESC-H9）7 d,采用CCK-8法检测不同浓度DEHP染毒后mESC-D3、3T3及hESC-H9细胞存活百分数和半数增殖抑制浓度(IC50)。根据细胞毒性实验结果,使用15.6、31.2、62.5、125.0、250.0、500.0μg/ml浓度的DEHP分别处理分化的mESC-D3、hESC-H9细胞10 d,采用Real-time PCR检测不同浓度DEHP作用下,分化标志基因心肌细胞肌球蛋白重链（α-MHC）的表达情况,拟合效应曲线,得出半数分化抑制浓度(ID50)。并将ID50、IC50代入线性判别函数公式进行计算与比较。结果细胞生长状态良好,免疫荧光染色可见未分化hESC-H9细胞高表达、干性关键转录因子八聚体结合转录因子（OCT4）、阶段特异性胚胎抗原（SSEA-4）及肿瘤排斥抗原（Tra-1-60）,细胞处于未分化状态。拟胚体大小均一、形态一致,可重复性高。采用ECVAM推荐已知发育毒性物质（5-FU和PN-G）对模型进行验证,所建模型有效,可用于受试物胚胎发育毒性的评价。DEHP对mESC-D3的IC50为210.0μg/ml、ID50为246.8μg/ml及对3T3的IC50为197.3μg/ml,代入线性判别函数公式得出函数Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ值分别为7.78、7.58、-7.79,因Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅲ,mEST模型评价DEHP为无胚胎发育毒性。DEHP对hESC-H9的IC50为184.8μg/ml,ID50为84.3μg/ml及对3T3的IC50为195.4μg/ml,代入线性判别函数公式得出函数Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ值分别为3.21、5.77、-6.46,因Ⅱ＞Ⅰ＞Ⅲ,hEST模型评价DEHP为弱胚胎发育毒性。结论 hEST模型相对于mEST模型在评价受试物的弱胚胎发育毒性方面可能更为敏感。