寡脱氧核苷酸MT01对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

摘要

目的探讨寡脱氧核苷酸 （ODN） MT01对大鼠骨髓间充质干细胞 （BMSCs） 形态、增殖及成骨分化的影响。方法 4周龄清洁级SD雄性大鼠5只,以全骨髓贴壁法培养SD大鼠BMSCs,通过观察不同代次的细胞形态、流式细胞仪检测表面相关标志物和成骨分化潜能,对所提取的干细胞进行鉴定。设立PBS组（对照组）和不同浓度 （0.5、1.0、2.0、4.0 μg/ml） ODN MT01组进行对照研究,每组实验重复3次。通过DAPI和鬼笔环肽荧光染色观察各组BMSCs细胞核及骨架的形态变化;通过CCK-8法检测不同时间各组BMSCs的增殖活性;成骨诱导培养基培养7 d和21 d, 分别行碱性磷酸酶染色及其活性检测和茜素红染色鉴定各组BMSCs的成骨分化程度。组间两两比较采用t 检验,多组间比较采用单因素方差分析,P＆0.05为差异有统计学意义。结果随着代次增加,BMSCs纯度越来越高,第3代细胞整体呈鱼群样分布。流式细胞仪分析结果显示,细胞高表达CD29 （99.8%）、CD44 （96.1%）,低表达CD11b （1.03%）、CD45 （1.74%）。成骨诱导7 d后碱性磷酸酶染色及21 d后茜素红染色均为阳性。细胞核及骨架染色显示,ODN MT01浓度为4.0 μg/ml时会导致BMSCs皱缩并降低伸展性。CCK-8结果显示,培养4 d时对照组吸光度值为0.446±0.018,1.0、2.0 μg/ml ODN MT01组分别为0.505±0.019、0.528±0.014,与对照组比较差异有统计学意义 （t=2.954、4.083,P=0.033、0.008）,培养7 d时对照组吸光度值为0.514±0.027,1.0、2.0 μg/ml ODN MT01组分别为0.607±0.007、0.636±0.023,与对照组比较差异有统计学意义 （t=4.664、6.091,P=0.009、0.008）,BMSCs增殖能力较对照组明显升高,而4.0 μg/ml ODN MT01 （0.427±0.013） 对BMSCs增殖能力具有抑制作用 （t=4.332,P=0.015）;诱导BMSCs成骨分化过程中随着ODN MT01浓度的升高,蓝色团块和矿化结节均显著增加,培养7 d后的碱性磷酸酶活性升高趋势与ALP染色结果相类似,对照组碱性磷酸酶活性为1.207±0.023,0.5、1.0、2.0、4.0 μg/ml ODN MT01组分别为1.747±0.095、2.200±0.136、3.560±0.088、3.490±0.144,与对照组比较差异均有统计学意义 （t=4.313、7.934、18.800、18.240,P=0.005、0.001、＆0.001、＆0.001）,而2.0、4.0 μg/ml组的诱导效果相比基本无差异 （t=0.562,P=0.590）。结论在不影响BMSCs形态的情况下,浓度为2.0 μg/ml的ODN MT01可显著促进BMSCs的增殖和成骨分化。