腺病毒介导BMP2和BMP7基因共转染骨髓间充质干细胞表达人BMP2/7异源二聚体

摘要

目的通过腺病毒介导BMP2及BMP7基因在大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）中共表达,探讨大鼠BMSCs作为基因共转移靶细胞的可行性,以及能否有效表达重组人源BMP2/7异源二聚体蛋白。方法 3只10周龄雄性Fischer大鼠,取其骨髓组织分离纯化BMSCs,并以贴壁法体外传代培养。同时构建并包装制备携带BMP2或BMP7靶基因的高滴度重组腺病毒备用。取体外培养的第3代BMSCs,按10 000个/cm2的细胞密度接种于6孔培养板,细胞贴壁培养过夜。实验组细胞加入无血清培养液稀释的携带BMP2和BMP7靶基因的腺病毒液各100μl（病毒感染复数分别为100 MOI）,而对照组细胞加入感染复数亦为200 MOI的携带GFP基因的阴性对照腺病毒液。细胞培养第7天后,收集该条件细胞培养上清,经抗人BMP7抗体交联的G蛋白亲合层析柱滤过,以获取抗体特异性免疫蛋白沉淀,用于Western Blot及ELISA检测BMP2/7异源二聚体的有效体外表达。结果成功构建携带有BMP2或BMP7目的基因的质粒载体并经HEK293T细胞包装成复制缺陷型重组腺病毒,Western Blot检测观察到BMP2在55 000大小处呈现有阳性目的条带,而目的基因BMP7则表现在49 000大小处有阳性条带;以阴性对照腺病毒Ad-GFP感染大鼠BMSCs 48 h,镜下见BMSCs贴壁良好,未见细胞毒性现象;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的显著表达;腺病毒载体介导BMP2和BMP7基因共转染大鼠BMSCs 48 h后,以Western-Blot检测细胞上清液,于47 000大小处检测到表达阳性的BMP2/7异源二聚体目的条带。ELISA定量则显示重组BMP2/7异源二聚体蛋白表达量为（4.33±0.42）ng/ml,对照组为（0.08±0.02）ng/ml,经配对样本t检验,2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论大鼠BMSCs是腺病毒介导基因转染的有效靶细胞,腺病毒携带BMP2和BMP7靶基因在BMSCs中实现了有效共表达,且获得了较高表达水平的人源重组BMP2/7异源二聚体蛋白,为下一步研究真核细胞表达BMP2/7异源二聚体蛋白诱导大鼠骨髓间充质干细胞的体、内外成骨实验奠定了基础。