新穿膜融合蛋白His-T1-绿色荧光蛋白的跨膜效率及其对细胞存活的影响

摘要

目的 研究穿膜融合蛋白His-T1-绿色荧光蛋白(GFP)的跨膜效率及其对细胞存活的影响.方法 以浓度为500 mg·L-1的His-T1-GFP与人鼻咽癌CNE2或大鼠肾小管上皮NRK52E细胞孵育6 h,应用荧光显微镜观察His-T1-GFP跨膜进入细胞的情况.应用多功能酶标仪检测细胞荧光强度,研究His-T1-GFP跨膜的动力学因素:以浓度为500 mg·L-1的His-T1-GFP与CNE2或NRK52E细胞孵育10 min至24 h,观察孵育时间对穿膜作用的影响;以浓度为25 mg·L-1至1.0 g·L-1的His-T1-GFP与两种细胞孵育6 h,观察蛋白浓度对跨膜效率的影响;以浓度为500 mg·L-1的His-T1-GFP与两种细胞分别在4℃和37℃的条件下孵育6 h,观察温度对蛋白跨膜效率的影响.用细胞乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒和MTT法来评价5.0 g·L-1浓度的His-T1-GFP对细胞存活的影响.结果 在一定浓度范围内,His-T1-GFP能够有效穿透CNE2和NRK52E细胞膜,且对NRK52E细胞的跨膜效率明显高于His-TAT-GFP.His-T1-GFP在10 min内就能有效跨膜进入细胞,并且在6 h内进入细胞的量与时间成正相关.在一定浓度范围(25 mg·L-1～1.0 g·L-1)内,该蛋白进入细胞的量与自身浓度成正相关,而在4℃时该蛋白仍具有跨膜能力.当其终浓度高达5.0 g·L-1时,对CNE2和NRK52E两种细胞几乎无毒性作用.结论 His-T1-GFP蛋白是一种跨膜效率高且低毒的穿膜融合蛋白.