甲醛固定石蜡包埋标本不同二代测序平台性能比较

摘要

目的应用甲醛固定石蜡包埋（FFPE）标本,以相同的建库方法,比较二代测序（NGS）技术Illumina公司的Miseq和Thermo公司的Ion Torrent PGM两个平台的性能和一致性,探讨临床应用价值。方法收集2013年1月至2016年12月的204例肿瘤FFPE标本,包括100例非小细胞肺癌（浙江大学医学院附属第一医院）和104例结直肠癌（四川大学华西医院）。采用相同的病例,一次提取DNA后,相同DNA的量采用相同试剂盒建库,质控合格后分别在Miseq和Ion Torrent PGM平台测序。使用扩增阻滞突变系统（ARMS）PCR法以及Sanger测序对双平台检测不一致的突变进行验证。结果共纳入204个FFPE标本,两个平台共同分析了197个标本。发现Miseq平台测序标本产出的reads数目高于PGM平台（中位数:391 634比298 030,P＜0.01）。与人类参照基因组进行比对,结果显示Miseq平台测序标本的比对率高于PGM平台（中位数100.0%比99.7%,P＜0.01）。Miseq平台测序标本的中位测序深度高于PGM平台（中位数853×比698×,P＜0.01）。两个平台共检测到236个突变,其中221个突变被两者同时检出（一致率93.6%）。Miseq平台比PGM多检出11个突变,而PGM平台比Miseq多检出4个突变。经ARMS-PCR方法及Sanger测序验证,Miseq平台对于低频突变的检测结果更为可靠,两者不一致的主要原因是部分假阴性是由变异频率低于试剂盒报告范围（5%）及石蜡标本保存时间较长导致。结论与PGM平台相比,Miseq平台测序在标本产生的reads数目、比对结果以及覆盖深度方面均表现出了更高的测序质量,且检测结果更为可靠。在临床实践中,应根据标本量和实际的通量需求来选择合适的平台辅助肿瘤分子检测。