褪黑素对H_(2)O_(2)诱导的成骨细胞氧化应激损伤的保护作用

摘要

目的探讨褪黑素对H_(2)O_(2)诱导的成骨细胞氧化应激损伤的保护作用机制。方法取24 h内新生SD大鼠10只,采用组织块贴壁法提取原代成骨细胞并行差速贴壁提纯细胞。细胞传至第2代时行碱性磷酸酶及茜素红染色进行鉴定。将鉴定后的成骨细胞用不同浓度的H_(2)O_(2)作用不同时间并行CCK8试验检测细胞增殖情况。选择合适的浓度和时间建立氧化应激损伤模型,并用褪黑素及EX527进行干预。实验分为对照组、H_(2)O_(2)组、褪黑素组及EX527组。分别对四组细胞行碱性磷酸酶染色、茜素红染色,检测四组细胞活性氧、丙二醛、超氧化物歧化酶含量,同时用流式细胞仪检测四组细胞凋亡率,免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl2和成骨相关蛋白BMP2、RUNX2以及SIRT1和p66SHC的表达量。结果经鉴定,成功提取原代成骨细胞。CCK8结果显示,400μmol/L H_(2)O_(2)作用4 h成骨细胞活性降至52%,适宜用于建立氧化应激损伤模型。H_(2)O_(2)作用后成骨细胞活性及矿化能力降低,ROS含量、MDA含量升高,SOD活性降低,细胞凋亡率升高,伴随有SIRT1、BMP2、RUNX2、Bcl2表达降低,p66SHC和Bax表达升高。褪黑素预处理后缓解了H_(2)O_(2)对成骨细胞的氧化应激损伤作用,部分恢复了成骨细胞的活性及矿化能力,SIRT1抑制剂EX527能够逆转褪黑素的上述作用。结论褪黑素通过调节SIRT1/p66SHC通路来抑制H_(2)O_(2)诱导的成骨细胞的氧化应激损伤并促进成骨。