CRX基因诱导Müller细胞源性干细胞定向分化为光感受器细胞的实验研究

摘要

目的研究外源性视锥视杆细胞同源盒（CRX）基因是否能够诱导体外培养的视网膜Müller细胞源性干细胞向光感受器细胞定向分化。方法实验研究。体外培养、扩增出生5～7 d昆明小鼠视网膜Müller细胞, 通过无血清培养去分化为干细胞。采用免疫细胞化学法分别鉴定Müller细胞（GS和Vimentin）和干细胞（Nestin和Sox2）标志物的表达。取第2代祖细胞分为3个组:空白对照组、空载体组[采用只含绿色荧光蛋白（GFP）基因的慢病毒转染细胞]、CRX组（用含GFP+CRX基因的慢病毒转染细胞）。诱导分化7 d后, 采用q-PCR、免疫印迹法检测光感受器细胞标志CRX蛋白、视紫红质（Rhodopsin）、感光蛋白S-opsin的表达差异。组间均数的两两比较采用独立样本t检验。结果体外培养的Müller细胞96.03%±1.21%同时表达GS和Vimentin标志物, 去分化后表达干细胞标志物Nestin和Sox2。CRX诱导分化7 d, CRX和Rhodopsin表达均明显增加, 部分细胞发生神经元样改变。CRX组、空载体组及空白对照组CRX mRNA相对表达量分别为10.830±2.301、1.214±0.469、1.000±0.576, CRX组与空白对照组相比, 差异有统计学意义（t=1.57, P=0.02）, 空载体组与空白对照组相比, 差异无统计学意义（t=0.29, P=0.84）。CRX组、空载体组及空白对照组Rhodopsin mRNA相对表达量分别为26.410±16.180、1.301±0.401、1.000±0.473, CRX组与空白对照组相比, 差异有统计学意义（t=4.15, P=0.01）, 空载体组与空白对照组相比, 差异无统计学意义（t=0.49, P=0.80）。CRX组、空载体组、空白对照组CRX蛋白相对表达量分别为1.258±0.358, 0.471±0.168, 0.442±0.152。未检测到S-opsin的表达。结论 CRX基因能够诱导小鼠Müller细胞源性干细胞定向分化为视杆细胞, 表明Müller细胞可以作为视网膜光感受器细胞替代治疗的内源性种子细胞。（中华眼科杂志, 2018, 54:923-928）