BIGH3基因定点突变体R555W的构建及其对人角膜上皮细胞的影响

摘要

目的构建野生型BIGH3和突变型R555W-BIGH3基因的真核表达载体,探讨其过表达对人角膜上皮细胞的影响。方法以pMD18-T/BIGH3载体为模板扩增野生型BIGH3基因全长编码序列,克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP上,采用快速体外定点诱变技术获得R555W突变体。瞬时转染体外培养的人角膜上皮细胞,免疫印迹检测野生与突变型BIGH3基因的表达,流式细胞仪和透射电镜定量和定性检查细胞凋亡,分析caspase3活性。多组间数据采用单因素方差分析进行统计学处理。结果 PCR成功扩增了野生型和R555W突变型的BIGH3基因。荧光显微镜下可见成功转染BIGH3/R555W-BIGH3-pIRES2-EGFP的CRL-11135细胞发绿色荧光,转染率为30.1%。瞬时转染48 h后的HCE细胞的上清液及其细胞裂解液免疫印迹分析显示,BIGH3/R555W-BIGH3-pIRES2-EGFP两组免疫印迹条带的密度比分别为1.26±0.06和1.27±0.08。正常HCE细胞组、转染pIRES2-EGFP空质粒及BIGH3-pIRES2-EGFP细胞凋亡率分别为（1.49±0.02）%、（1.53±0.02）%、（1.50±0.06）%,转染R555W-BIGH3-pIRES2-EGFP组细胞凋亡率达到19.46%±0.08%。差异有统计学意义（F=175 261.23,P＜0.01）。透射电镜下可见转染组细胞核内染色质凝集,固缩,分布于核膜下,核仁消失,有的胞核碎裂,细胞呈典型的凋亡改变。转染R555W-BIGH3-pIRES2-EGFP组caspase-3活性为561.03±1.05,与其他组相比,差异有统计学意义（F=629 347.38,P＜0.01）。结论应用快速体外定点诱变技术,成功获得突变型R555W-BIGH3基因,转染人角膜上皮细胞后,通过caspase3途径引起细胞凋亡。（中华眼科杂志,2010,46:56-61）