X染色体相关凋亡抑制蛋白的小分子干扰RNA对卵巢上皮性癌细胞生长的影响

摘要

目的探讨 X 染色体相关凋亡抑制蛋白（XIAP）的小分子干扰 RNA 对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞系 SKOV3细胞生长的影响。方法设计和合成长度为64 nt 的脱氧寡核苷酸链,克隆至 pSUPER 质粒,转化大肠埃希菌 DH5α菌株,构建重组质粒 pSUPER-siXIAP,对其进行双酶切和DNA 序列分析鉴定。间接免疫荧光染色法鉴定 SKOV3细胞 XIAP 蛋白的表达。实验分为4组:分别用重组质粒 pSUPER-siXIAP（pSUPER-siXIAP 组）及阴性无关序列重组对照质粒 pSUPER-nsRNA（pSUPER-nsRNA 组）及空载体质粒 pSUPER（pSUPER 组）转染 SKOV3细胞,以未转染质粒的 SKOV3细胞为空白对照组。RT-PCR 技术检测各组细胞 XIAP mRNA 的表达,蛋白印迹法检测各组细胞XIAP 蛋白的表达,流式细胞仪分析各组细胞细胞周期的变化,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法观察各组细胞生长的变化。结果本实验成功构建了 XIAP 特异性的 RNA 干扰载体 pSUPER-siXIAP 质粒。间接免疫荧光染色法检测证实 SKOV3细胞中存在 XIAP蛋白的过度表达。转染后72 h,SKOV3细胞XIAP 蛋白表达水平降低,空白对照组、pSUPER 组、pSUPER-nsRNA 组及 pSUPER-siXIAP 组的相对密度值分别为3584±124、2138±65、1973±80和110±12,各组间比较,差异有统计学意义（P=0.0334）;转染后72 h,SKOV3细胞 XIAP mRNA 表达水平明显下降,空白对照组、pSUPER 组、pSUPER-nsRNA 组及 pSUPER-siXIAP 组各组的相对密度值分别为6674±274、4532±107、2322±57和1864±78,各组间比较,差异有统计学意义（P=0.0127）。流式细胞仪检测结果显示,pSUPER-siXIAP组 G1期细胞较空白对照组、pSUPER 组明显增加（P＜0.05）;pSUPER-siXIAP 组 S 期细胞较空白对照组、pSUPER 组明显减少（P＜0.05）。MTT 比色法检测结果显示,pSUPER-siXIAP 组细胞生长增殖被抑制,生长速度较空白对照组细胞明显减慢（P=0.0237）;pSUPER-nsRNA 组和 pSUPER 组细胞生长速度较空白对照组细胞也明显减慢（P=0.0441,P=0.0472）。结论本研究成功构建了 XIAP RNA干扰载体 pSUPER-siXIAP 质粒,将其转染 SKOV3细胞后可有效降低其 XIAP mRNA 及蛋白的表达水平,并将 SKOV3细胞阻滞于 G1期,造成转染细胞生长速度减慢,这有望为卵巢癌基因治疗提供一个新的有希望的分子靶点。