羊膜上皮细胞水通道蛋白3表达的cAMP-PKA信号通路调控机制

摘要

目的探讨羊膜上皮细胞水通道蛋白3（AQP3）表达过程中环磷酸腺苷-蛋白激酶A（cAMP-PKA）信号传导通路的调控机制。方法选择2012年1至11月温州医科大学附属第二医院无并发症、羊水量正常的足月孕妇30例,剖宫产时取羊膜进行上皮细胞培养,并进行如下分组实验:（1）毛喉素组:不同浓度的毛喉素（forskolin,0、2.5、5、50、100μmol/L）作用羊膜上皮细胞2 h,再以最适宜浓度的forskolin作用不同时间（0、1、2、10、20 h）;（2）SP-cAMP组:不同浓度的PKA激动剂SPcAMP（0、2.5、5、50、100μmol/L）作用羊膜上皮细胞2 h,再以最适宜浓度的SP-cAMP作用不同时间（0、1、2、10、20 h）;（3）H-89组:不同浓度的PKA抑制剂H-89（0、5、10、50、100μmol/L）作用人羊膜上皮细胞2 h,再以最适宜浓度H-89作用不同时间（0、1、2、10、20 h）。采用ELISA方法检测各组细胞内CAMP水平及PKA活性,免疫细胞化学染色法检测AQP3表达定位,蛋白印迹法检测总cAMP反应元件结合蛋白（CREB）、磷酸化CREB（p-CREB）和AQP3表达水平,采用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞增殖率。结果 （1）各组羊膜上皮细胞的胞质及胞膜均有AQP3蛋白表达。（2）各组不同浓度forskolin、SP-cAMP和H-89作用羊膜上皮细胞后,细胞增殖率无明显变化,分别比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。（3）不同浓度forskolin作用羊膜上皮细胞2 h,总CREB表达水平比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。cAMP水平、PKA活性、P-CREB和AQP3表达水平分别比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）,2.5、5、50μmol/L forskolin作用后,上述4种因子均高于0μmol/L（P＜0.05）;而5μmol/L明显高于2.5、50μmol/L（P＜0.05）。forskolin作用的最适宜浓度为5μmol/L。（4）不同浓度SP-cAMP作用羊膜上皮细胞2 h,细胞中cAMP和总CREB表达水平分别比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。PKA活性、p-CREB和AQP3表达水平比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）;SPcAMP浓度为5、50μmol/L时,上述3种因子高于0μmol/L（P＜0.05）;50μmol/L时明显高于5μmol/L（P＜0.05）。SP-cAMP作用的最适宜浓度为50μmol/L。（5）不同浓度H-89作用羊膜上皮细胞2 h,细胞中cAMP水平和总CREB表达水平比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。PKA活性、p-CREB和AQP3表达水平比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）;H-89浓度为10、50和100μmol/L时,上述3种因子均低于0μmol/L（P＜0.05）,10μmol/L时明显低于50和100μmol/L（P＜0.05）。H-89作用的最适宜浓度为10μmol/L。（6）5μmol/L forskolin联合10μmol/L H-89作用2 h后,羊膜上皮细胞中总CREB表达水平比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。p-CREB与AQP3表达水平比较,低于5μmol/L forskolin作用2 h（P＜0.05）,但高于10μmol/L H-89作用2 h（P＜0.05）。结论 cAMP-PKA信号传导通路对羊膜上皮细胞中AQP3蛋白的表达起调控作用。