EGFR和PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达

摘要

目的 构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体（EGFR-CAR）和程序性死亡受体-配体1（PD-L1）抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法 人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤,酶联免疫吸附试验（ELISA）和Western blot检测抗体特异性,流式细胞术（FACS）鉴定对PD-1配受体封阻性能,Fortebio测定抗体亲和力,抗体全长测序,经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体（single-chain variable fragment,scFv）；人EGFR单克隆抗体杂交瘤系,经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区（VL和VH）基因,构建scFv,克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR（引入CD137协同信号胞内功能域）与PD-L1-scFv借助2A序列连接,克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体,使用Lenti-X Packaging Single Shots （VSV-G）共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,FACS测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况,转染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果 获得PD-L1抗体11E3,具备高度配受体封阻性能,经人源化改造后,亲和力稳定（2.67×10－10 mol/L）,EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR（CTC0537-1）及膜表达型CAR（CTC0537-2）,其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-scFv,检测培养上清存在PD-L1-ScFv；CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达,双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。结论 成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。