新型高通量肺癌相关基因甲基化检测方法的建立

摘要

目的建立一种包含甲基化标准品的新型高通量肺癌相关基因的甲基化检测系统。方法 2009年3—6月上海交通大学医学院附属胸科医院经病理学和影像学确认的非小细胞肺癌患者8例,其中男7例,女1例,平均年龄（57±11）岁,手术后留取肺癌组织及外周血。男性健康志愿者1名,年龄35岁,抽取外周血20 ml,用以分离单个核细胞提取DNA制备质粒。对7个肺癌相关基因的启动区进行克隆,用各基因的特异性引物对克隆到质粒中的各基因片段再次进行扩增,PCR产物用甲基化酶M.SssⅠ和亚硫酸盐处理。通过设计3′末端CpGpCpG探针来识别甲基化模板,并经最佳连接酶、最佳退火温度及连接温度的选择,建立一套多重连接PCR体系,最后运用液相芯片平台对扩增的标准品和临床标本进行检测。利用甲基化特异性PCR检测新系统的可靠性。结果成功的构建了7个基因的甲基化和非甲基化标准品,并建立了多重PCR偶联液相芯片的快速检测系统,p16INK4A、APC、DAPK、RARβ、RASSF1A、MGMT和GSTP1甲基化标准品的荧光信号值分别为863、909、703、701、901、1 060和885,与非甲基化标准品区分明显。抽提8例患者的肺癌组织DNA,对其中检测出阳性频率较高的基因进行甲基化特异性PCR,产物电泳结果与新建甲基化检测系统检测结果完全一致。结论本研究建立的新型检测系统能同时准确地检测7个基因甲基化状态,有望应用于临床标本的检测。