非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因突变富集液相芯片检测方法的建立

摘要

目的建立灵敏、特异、简便易行、高通量血浆检测非小细胞肺癌（NSCLC）表皮生长因子受体（EGFR）基因突变热点的突变富集液相芯片法（MEL）。方法设计EGFR外显子19 E746-750缺失和外显子21 L858R突变及野生型的特异探针,并偶联到不同荧光编码微球上,用生物素标记的探针反向序列交叉试验验证探针偶联效果后,与突变富集PCR产物互补配对杂交,然后经液相芯片仪检测分析,建立血浆检测EGFR突变的MEL技术。将不同拷贝数突变型与野生型质粒混合做模板,检测MEL的灵敏度与特异性。收集2008年9月至2010年4月在广州医学院第一附属医院住院的201例ⅢB或Ⅳ期NSCLC患者血浆标本,用突变富集PCR和MEL平行检测EGFR外显子19、2l突变,同时筛选经2种方法鉴定过的50例标本的PCR产物,经直接测序验证MEL的灵敏度与特异性。并初步分析16例肺腺癌患者血浆EGFR基因突变与吉非替尼治疗疗效的关系。结果探针成功偶联到不同荧光编码的微球上,且可特异识别相应靶序列,MEL可检出低至10个拷贝的EGFR突变（灵敏度0.1%）。201例NSCLC患者中,MEL共检出EGFR外显子19 E746-750缺失和外显子21L858R突变112例（55.7%）,与突变富集PCR检出率[58.2%（117/201）]相比,差异无统计学意义（X~2=3.20,P＞0.05）,符合率为97.5%（196/201）;直接测序法从50例NSCLC患者中仅检出EGFR突变11例（22.0%）,且低于MEL[50.0%（25/50）,X~2=12.07,P＜0.05]。经Fisher精确检验,接受吉非替尼治疗的肺腺癌患者中,9例血浆EGFR外显子19突变阳性患者较7例阴性患者具有较高的客观缓解率（P=0.041）和较长的疾病无进展生存期（X~2=6.76,P=0.009）。结论成功构建了一种灵敏、特异、快速、高通量的NSCLC血浆诊断EGFR基因外显子19 E746-750缺失和外显子21 L858R突变的MEL检测平台,对指导晚期肺癌患者个体化治疗有重要价值。