微量酶联夹心杂交法定量检测TNF—αmRNA

摘要

目的：建立一支高灵敏度、高特异性、精确、简便的微板酶联夹心杂交技术，对人单核细胞分泌的TNF－αmRNA进行定量检测。方法：设计两条特异探针，其中一条为捕获探针，5’端带有氨基修饰，可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合，而且是“竖直”地包被在微孔内，另一个为检测探针，3'端带有生物素标记。提取人单个核细胞总RNA，RT－PCR后的扩增产物经变性后加入已包被好捕获探针的微孔板中，加入检测探针与已杂交的产物结合，最后加入亲和素一辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)显色系统催化底物显色，450nm波长下检测吸光度进行定量。结论：该方法检测TNF－αmRNA的灵敏度，明显高于琼脂糖凝胶电泳，而且具有良好的重复性，等量PCR产物作10个复孔，吸光度的CV值为7．2％，批间的CV值为9．1％。在本实验中，我们疼守试着用客观的数据来表示正常人中1×105个BPMCs中TNF－αmRAN的平均表达量,发现该表示方法直观明了，结果稳定， 而且简便可行，不需要特殊的仪器及昂贵的试剂。结论：本方法具有高灵敏度、高特异性、精确、简单易操作，结果数据化等优点，适合于微量细胞因子mRNA的定量检测。