百草枯诱导多巴胺能神经元α-突触核蛋白的自噬性降解障碍机制

摘要

目的 探讨百草枯（PQ）对人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）自噬水平的影响及诱导α-突触核蛋白（α-syn）异常聚集的机制。方法 以SH-SY5Y细胞作为多巴胺能神经元的体外模型,不同浓度PQ（0、18.75、37.5、75、150、300、600 μmol/L）处理细胞24 h,150 μmol/L PQ处理细胞不同时间（0、12、24、36、48、60、72、96 h）,每组设5个复孔。CCK8法检测细胞相对存活率,确定剂量/时间-效应关系；不同浓度PQ （0、75、150、300、600 μmol/L）处理细胞24 h,150 μmol/L PQ处理细胞不同时间,检测细胞LDH活力；蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞内自噬微管相关蛋白轻链3（LC3）、自噬相关蛋白（Beclin1）、Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶（Vps34）、泛素结合蛋白（p62）及α-syn表达水平；实时荧光定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测α-syn基因表达水平；免疫荧光法（Immunofluorescencetechnique,IF）检测α-syn表达水平；用自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin,RAPA） 100 nmol/L预处理细胞6 h,Western blot检测处理前后细胞内自噬相关蛋白及α-syn的蛋白表达水平。结果 PQ染毒细胞24 h后,细胞相对存活率明显降低,差异有统计学意义（P＆0.05）。与正常对照组比较,PQ呈剂量依赖性和时间依赖性抑制SH-SY5Y细胞的增殖活性（P＆0.05）；与正常对照组比较,染毒组细胞上清中LDH活力明显升高（P＆ 0.05）；Western blot结果显示,与正常对照组比较,染毒组细胞内自噬相关蛋白比值（LC3II/LC3I）、Beclin1和Vps34蛋白表达水平明显下降（P＆0.05）,p62蛋白表达水平升高（P＆0.05）；细胞内α-syn蛋白和基因表达水平均明显升高（P＆0.05）；IF结果显示,经PQ处理后,细胞内α-syn荧光信号明显聚集于胞质,荧光强度增强（P＆0.05 ）；Western blot结果显示,与染毒组比较,RAPA干预组的LC3II/LC3I、Beclin1和Vps34蛋白表达水平明显升高（P＆0.05）,α-syn蛋白表达水平明显下降（P＆0.05）。结论 PQ可能通过诱导SH-SY5Y细胞自噬功能障碍,引起细胞内α-syn的异常聚集。