利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼ifi30基因

摘要

利用CRISPR/Cas9技术,在斑马鱼Danio rerio干扰素γ诱导蛋白30(ifi30)基因的第一个外显子处选取靶位点,用PCR法构建gRNA,并进行体外转录.将体外转录的sgRNA和Cas9mRNA显微注射到斑马鱼1细胞期的受精卵中,实现对靶基因ifi30的沉默.注射后24h检测发现,基因突变率在79％～95％之间,平均突变率为87.2％.为了获得稳定遗传的基因突变纯合系,将F0代与野生型斑马鱼进行配组,获得了3种突变类型的F1代,其突变率为30％.三种突变类型中突变1和突变2为移码突变,突变3删除了6个碱基,并未造成移码.突变1和突变2的F1代杂合个体生长发育未见异常.将杂合F1代自交,理论上将获得突变纯合个体,但仅在受精2h以内的胚胎中检测到了突变纯合个体,受精24h后的胚胎中,只有野生型和杂合型,未见突变纯合个体.推测ifi0基因的移码突变造成了干扰素γ诱导蛋白的缺失,导致胚胎死亡.