定点突变的人胰岛素原基因在体细胞中的表达

摘要

目的研究在非β细胞中表达成熟胰岛素,探讨替代胰岛素注射或胰岛移植治疗Ⅰ型糖尿病的方法.方法采用重叠区扩增基因拼接法(gene SOEing)自胰岛素原基因组基因中扩增胰岛素原的cDNA,并于C肽的两端引入蛋白酶furin的识别和切割位点Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg,将获得的突变体重组表达载体pcDNA3.1/C.mINS通过脂质体法转染体外培养的Hela、293和L02细胞,转染后48、72h取细胞培养液;并将 L02细胞经G418(450mg/L)筛选2个月后,得到稳定表达胰岛素的细胞株,同时用放射免疫和免疫组织化学的方法监测细胞内外胰岛素的表达水平.结果成功地对胰岛素原cDNA的3个位点进行了突变,空载体转染的细胞无胰岛素表达,而在转染突变后胰岛素原基因cDNA的细胞培养液中胰岛素的表达量各不相同:每天8.45～188.00μIU/2.0×106Hela细胞、每天159.88～242.14μIU/2.0×106 293细胞、每天2.56～61.95μIU/2.0×106 L02细胞;免疫组织化学显示细胞浆内有囊泡状分泌颗粒.结论突变的胰岛素原cDNA能成功转染非胰岛β细胞并表达胰岛素.