羊膜对人视网膜色素上皮细胞增生和分化的影响

摘要

背景人视网膜色素上皮（RPE）细胞移植治疗视网膜变性性疾病是目前的研究热点之一，许多生物载体可制备RPE细胞单层，但多存在着细胞毒性、稳定性差及免疫反应等问题。目的检测羊膜对人RPE细胞增生和分化的影响，探讨其作为人RPE细胞层载体进行移植的可能性。方法将RPE细胞系ARPE-19细胞株用含质量分数10％胎牛血清的DMEM／F12培养基进行培养和传代，8～12代细胞用于实验。将传代细胞分为2个组，一组细胞接种于去上皮羊膜作为实验组，另一组细胞直接在培养孔内进行培养作为对照组。分别于接种后24、48、72、96h行MTT实验，测定RPE细胞的吸光度（A492）值以评估两组细胞在增生能力方面的不同；培养3周后的细胞层行苏木精-伊红染色，检测细胞在不同培养载体上是否存在形态学方面的区别；分别收集同一孔中生长于羊膜和培养板表面的细胞，采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测色素上皮衍生因子（PEDF）、钙黏蛋白（N—cadherin）、β-连环蛋白（β—catenin）以及细胞连接相关蛋白的表达情况；同时收集培养3周时的细胞行透射电子显微镜和扫描电子显微镜检查，比较不同载体培养的ARPE-19细胞在超微结构方面的区别。结果与对照组相比，实验组细胞增生的速度明显变缓，两组细胞增生情况比较差异有统计学意义（F=41．760，P=0．000）。苏木精-伊红染色结果显示，同一培养孔内实验组的细胞密度明显低于对照组，说明羊膜对ARPE-19细胞增生的影响不是通过细胞分泌的可溶性因子的作用。RT—PCR结果显示，实验组细胞连接相关蛋白claudin 1、N—cadherin和PEDF mRNA在培养细胞上的表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（t=15．828，P=0．000；t=6．839，P=0．002；t=14．667，P=0．000）；Connexin 43的表达低于对照组，差异有统计学意义（t=3．358，P=0．024）。超微结构分析发现羊膜载体上的细胞呈典型的多边形RPE细胞表型，分化现象明显，而普通培养板培养的RPE细胞形态主要呈梭形，细胞层厚薄不均。结论去上皮羊膜为载体培养的RPE细胞增生速度变慢，但培养的细胞分化程度较高，提示羊膜可作为RPE细胞体外培养的良好载体，用于制备移植所需功能成熟的RPE细胞片层。