雷帕霉素对缺氧损伤视网膜神经节细胞的保护作用及其机制

摘要

背景研究表明雷帕霉素（Rapa）可延缓人大脑细胞的衰老，改善大鼠局灶性脑缺血时脑组织代谢活动，对中枢神经细胞具有保护作用。视神经和视网膜神经节细胞（RGCs）属于中枢神经组织，但Rapa是否可对外伤后RGCs具有保护作用尚不清楚。目的探讨Rapa对氯化钴（CoCl2）诱导的缺氧损伤大鼠RGCs的保护作用，并探讨其可能的作用机制，为外伤性视神经病变（TON）的治疗提供新的思路。方法用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养大鼠RGC-5细胞，倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态学变化。将细胞分为正常对照组及50、100、200、400和600 μmol/L CoCl2组，于细胞培养后24 h和48 h采用细胞生长分析系统检测各组细胞存活率。采用200 μmol/L CoCl2处理细胞以诱导建立RGC-5细胞缺氧损伤模型，然后将培养的细胞分为正常对照组、模型对照组和不同浓度Rapa干预组，Rapa干预组在缺氧模型细胞培养液中添加Rapa使其终浓度分别为0.1、0.4、1.6和6.4 μmol/L，处理细胞24 h。采用细胞生长分析系统检测各组细胞的存活率；采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率；采用JC-1染色技术检测各组细胞线粒体跨膜电位（ΔΨm）的变化；采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞促凋亡基因bax mRNA的相对表达量。结果200 μmol/L CoCl2作用RGC-5细胞后24 h细胞相对存活率为（70.51±5.00）%，与正常对照组的（100.00±3.29）%比较，差异有统计学意义（P〈0.01），成功构建细胞缺氧损伤模型。正常对照组、模型对照组和0.1、0.4、1.6、6.4 μmol/L Rapa干预组细胞存活率的总体比较差异有统计学意义（F＝167.904，P＝0.000），其中0.1 μmol/L Rapa干预组细胞存活率明显高于模型对照组，差异有统计学意义（P〈0.05）。正常对照组、模型对照组和0.1 μmol/L Rapa干预组细胞凋亡率分别为25.4%、37.7%和25.3%，细胞线粒体膜电位分别下降了0.4%、6.3%和1.4%。正常对照组、模型对照组和0.1 μmol/L Rapa干预组细胞中bax mRNA相对表达量分别为1.01±0.21、3.52±0.30和1.66±0.20，总体比较差异有统计学意义（F＝88.034，P＝0.000），其中模型对照组细胞中bax mRNA相对表达量均明显高于正常对照组和0.1 μmol/L Rapa干预组，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。结论Rapa可对CoCl2诱导的缺氧RGC-5细胞发挥保护作用，其主要作用机制是下调细胞中促凋亡分子bax的表达，并提高RGC-5细胞存活率。