乙型肝炎病毒B基因亚型（Ba，Bj）半巢式PCR检测方法的建立

摘要

目的建立一种灵敏特异且简便易行的乙型肝炎病毒（HBV）B基因Ba和Bj亚型分型方法。方法用DNAStar软件比较分析GenBank中登录的B基因型HBV（HBV/B）和C基因型HBV （HBV/C）的基因序列,分别设计出HBV/B型特异性引物HB及Ba和Bj基因亚型特异性引物BA和BJ。第一轮PCR反应以HBV/B型特异性引物HB作为上游引物,以日本学者Sugauchi等设计的引物HBAS-4V作为下游引物（外引物）;第二轮PCR反应同样以HB作为上游引物,亚型特异性引物BA和BJ作为下游引物（内引物）,在同一个反应管中进行。根据PCR产物片段的大小判定B基因亚型。随机选取实验室内经型特异性引物PCR法鉴定为HBV/B（56份）及经preS/S区序列测定证实为HBV/C（15份）的HBV慢性感染者血清标本共71份,以研究设计的引物进行半巢式PCR反应,检测Ba和Bj基因亚型,并以载有HBV Bj亚型基因组的质粒作为Bj亚型的阳性对照。然后随机选取15份B型样本的第一轮PCR产物直接测序,利用Blast和DNAStar软件将测序结果与GenBank中登录的Ba及Bj亚型序列进行同源性分析,验证该半巢式PCR法的准确性。结果56份HBV/B血清标本经该半巢式PCR法检测,均为Ba亚型,随机选取的15份B型PCR产物直接测序,结果均为Ba亚型,与研究中应用的半巢式PCR方法检测结果一致。15份HBV/C的血清标本检测结果均为阴性。结论建立了HBV Ba和Bj亚型半巢式PCR法。该方法灵敏、特异、简便、易行,可用于临床和流行病学大样本检测。