细菌内同源重组构建含人内皮抑素基因腺病毒及在胃癌细胞中的体外转染实验

摘要

目的:采用细菌内同源重组法构建含人内皮抑素基因的重组腺病毒Ad-CMV-hEn.方法:将hEn基因自pCA13-hEn质粒中酶切下来,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒pAdtrack-CMV-hEn,并用PmeⅠ线性化后与腺病毒基因组质粒pAdeasy共转化大肠杆菌BJ5183,抽提重组体腺病毒基因组质粒DNA,PacⅠ酶切后在293细胞中包装成腺病毒颗粒.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,同时测定了病毒滴度.并采用RT-PCR检测感染腺病毒的胃癌细胞内有无hEn mRNA的转录.结果:由pAdtrack-CMV-hEn和pAdeasy共转化大肠杆菌BJ5183后,可得到阳性重组体细菌克隆,包装完成的腺病毒经PCR检测表明已含有hEn基因.纯化所得腺病毒滴度约为2.4×1011 pfu/ml.RT-PCR证实在感染重组体腺病毒Ad.CMV-hEN的细胞中有相应mRNA的转录.结论:细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法.所构建的Ad-CMV-hEn在体外能有效转录相应的mRNA.