siRNA干扰HIF-1α抑制人外周血内皮祖细胞分化

摘要

背景与目的:低氧诱导因子鄄1α(hypoxiainduciblefactor鄄1alpha,HIF鄄1α)在促血管新生中起关键作用,通过基因沉默方法研究促肿瘤发展因子对细胞分化的影响可为体内抗癌治疗提供指导。本研究构建了HIF鄄1α的RNA干扰(RNAi)质粒,在体外研究其对人外周血内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)向血管内皮细胞(endothelialcell,EC)分化的影响。方法:质粒重组技术构建siRNA鄄HIF鄄1α质粒,电穿孔转染质粒,计算转染效率;RT鄄PCR法检测HIF鄄1α、HIF鄄1β及血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)mRNA在质粒转染前后含量变化;免疫组化方法检测在常氧/低氧下和siRNA鄄HIF鄄1α质粒转染后12hHIF鄄1α蛋白表达情况;流式细胞术测定FITC鄄CD31+的EPCs/EC在各组细胞转染3～10天后的组间差异;一氧化氮酶法鉴定各组细胞VEGF依赖性一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase,eNOS)含量;镜下观察转染前后细胞形态及分化程度。结果:重组子质粒测序鉴定证实siRNA鄄HIF鄄1α构建与设计相符,电转效率约20%;转染6h各组HIF鄄1αmRNA在常氧中及低氧中均表达,并可被siRNA鄄HIF鄄1α不同程度抑制(P0.05)。免疫组化示常氧及低氧1hHIF鄄1α蛋白无表达,低氧3h成倍出现,6h达高峰,24h降至基线水平;siRNA鄄HIF1α抑制后低氧12h,HIF鄄1α蛋白表达被显著抑制。流式细胞仪检测发现,经siRNA鄄HIF鄄1α抑制后CD31+细胞较对照组在常氧及低氧中表达下调(P<0.05)。siRNA减少eNOS含量,并与培养时间及VEGF刺激浓度呈反比(P<0.01)。细胞形态学观察示低氧可诱导并加速EPCs向EC定向分化、扩增,但可被siRNA鄄HIF鄄1α抑制。结论:固有的或低氧诱导的HIF鄄1α表达足以影响下游靶基因表达,siRNA能抑制促血管新生的靶基因,抑制EPCs向EC分化。