ATM与辐射激活的磷酸化P53、P21蛋白的相互作用

摘要

背景与目的:ATM基因属于PI-3K激酶家族成员,其编码蛋白具有调控DNA修复过程和调整细胞周期关卡的功能。毛细血管扩张性共济失调症(ataxia-telangiectasia,AT)患者AT细胞中ATM基因的突变导致了辐射诱发的P53、P21磷酸化缺失,说明辐射激活ATM基因可调控P53、P21的磷酸化。本实验利用免疫共沉淀及Westernblot技术来研究辐射激活的ATM基因与p53的关系,并观察ATM基因是否不通过P53而直接调控P21的磷酸化。方法:利用电穿孔技术将含有ATM基因cDNA的真核表达载体pEBS7-YZ5转染到AT细胞中,用潮霉素筛选以获得稳定表达细胞株,RT-PCR检测ATMcDNA的转录以进一步验证;在ATM稳定表达的AT细胞中,利用免疫共沉淀及Westernblot技术研究ATM基因与p53基因的相互关系;以K562细胞(p53突变)为p53突变细胞模型,研究ATM是否直接磷酸化P21。结果:pEBS7-YZ5成功转进AT细胞,RT-PCR检测到ATMcDNA片段;ATM稳定表达的AT细胞株在电离辐射诱导下,P53被磷酸化,免疫共沉淀显示ATM与P53相互作用;K562细胞经60Coγ射线照射后,P21被磷酸化,ATM抗体免疫共沉淀物中检测到P21蛋白的存在。结论:细胞遭受电离辐射作用后所激活的ATM激酶,可通过磷酸化P53继而活化细胞周期检控点P21蛋白,也可在电离辐射导致DNA损伤早期直接磷酸化P21蛋白,来启动DNA修复机制。