猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

摘要

根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2)序列(AY035820),设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因.将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE/gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒-伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1-ORF2.采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1-ORF2与伪狂犬病毒TK-/gE-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2 ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK-/gE-/gI-/ORF1-ORF2+,用Southern blotting鉴定重组病毒,并用Western blotting检测ORF1-ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度.结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK-/gE-/LacZ+亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应.同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当.