碱性果胶酶高产菌株的构建和高密度发酵

摘要

碱性果胶酶可用于苎麻脱胶和棉织物前处理的精练工艺,与传统的高温碱煮相比,具有保护纤维、降低能耗和化学污染的优势,因此获得高表达的碱性果胶酶基因工程菌,低成本生产碱性果胶酶对于纺织工业节能减排具有重要的意义.前期研究工作已经将来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的碱性果胶酶基因pel经过密码子优化后在毕赤酵母Pichia pastoris GSll5中成功表达.本研究为了提高其表达量,首先利用启动子和信号肽都优化的载体pHBM905BDM进行表达,摇瓶酶活从68 U/mL增加到100 U/mL,qPCR检测转录水平提高了27％.再利用果胶底物平板筛选水解圈大的转化子进行摇瓶发酵获得菌株GS 115-pHBM905BDM-pels4,摇瓶酶活为536 U/mL.随后构建重组质粒pPIC9K-pels,电转化菌株GS 115-pHBM905BDM-pels4,利用抗生素G418平板进行筛选,在含4 mg/mL的G418抗性平板上得到菌株GS 115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1,摇瓶酶活为770 U/mL,qPCR测定含7个拷贝目的基因.最后将该菌株在5L的发酵罐中进行高密度发酵,果胶酶酶活提高至2 271 U/mL.该碱性果胶酶酶活已达到目前酵母表达的最高水平,说明其具有很好的应用于纺织工业的潜力.