佛波酯诱导THP-1细胞分化条件的优化及自噬模型的建立

摘要

目的 探讨佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导THP-1细胞(人类单核/巨噬细胞)分化的最优条件,建立相关自噬模型,为基于细胞自噬模型的研究奠定实验基础.方法 采用PMA诱导THP-1细胞分化成巨噬细胞;用表达融合蛋白pcDNA3.1-YFP-LC3质粒转染THP-1细胞,YFP为黄绿色荧光蛋白,以示踪自噬体的形成.采用倒置显微镜观察不同浓度(0、10、20、50、100、200 ng/ml)、不同时间(0、24、48、60 h)PMA分化细胞形态学变化;采用荧光显微镜示踪不同条件下LC3点聚集的增强;实时荧光定量聚合酶链式反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测自噬相关基因mRNA的表达.采用SPSS17.0软件进行统计分析.mRNA相对含量2-△△Ct用“(x)±s”表示.经比较Ct值法分析基因表达差异.Earle's balanced salts solution(EBSS,又称饥饿培养基),诱导细胞自噬相关基因mRNA表达量变化的比较采用t检验分析,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 PMA浓度为100 ng/ml、诱导时间为24～48 h时,THP-1细胞分化成巨噬细胞的形态学状态较理想.饥饿培养基EBSS处理分化的THP-1细胞,能增加自噬体YFP LC3点聚集,其自噬相关基因LC3、Atg5、Atg7、Beclin1的mRNA表达水平显著增加(2-△△Ct均值分别为1.35±0.16、1.18±0.39、1.44±0.12、1.08±0.09,t值分别为4.00、2.90、5.16、3.57,P值均＜0.05).结论 PMA在浓度为100 ng/ml、24～48 h时诱导THP-1分化为巨噬细胞状态较理想;成功构建了THP-1源性细胞自噬模型.