区分犬瘟热病毒Asia-Ⅰ型野毒株及疫苗株的AS-PCR方法

摘要

犬瘟热是一种接触性传染病,可侵害免疫系统、呼吸系统、消化系统,甚至神经系统,导致全身性的病理变化,对宠物犬、毛皮动物等存在巨大威胁.目前常用的胶体金检测法不能有效区分疫苗免疫与动物自然感染.为建立一种高效准确的鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的检测方法,本试验对从武汉地区收集已确诊犬瘟热的6只犬分离得到的野毒株以及3株广泛使用的CDV疫苗株进行全基因组测序,从氨基酸水平和碱基水平比对分析后,确定H基因为AS-PCR引物设计的靶基因.通过对H基因进行分型,发现武汉地区流行的CDV均为Asia-Ⅰ型,而疫苗株Y2为America-Ⅰ型,疫苗株Y1和Y3均为America-Ⅱ型.对比179株Asia-Ⅰ型(6株野毒株样品+173株GenBank Asia-Ⅰ型)与3株疫苗株的CDV-H基因序列,采用AS-PCR技术(3'端错配)设计出1对能有效区分犬瘟热Asia-Ⅰ型野毒株和疫苗株的特异性引物,上游引物序列为5'-TTAAATGATAATGACATAGTG-3',下游引物序列为5'-CCTGGCAAGGCAAGA-3'.结果 显示该引物有较强的特异性,6株样品野毒株均可扩增出长894 bp的片段,疫苗株不能扩增,且野毒株的H基因上存在9个较为规律的碱基(氨基酸)变异位点,而疫苗株在第277位氨基酸上均为天冬酰胺,这些变异可能导致N-糖基化位点的增加,从而对犬瘟热病毒疫苗株的毒力产生影响.本研究建立的AS-PCR方法能有效区分犬瘟热疫苗和Asia-Ⅰ型野毒株.