绵羊YAP1基因的克隆及其真核表达载体和突变型载体的构建

摘要

本研究旨在克隆绵羊YAP1基因CDS序列,构建并鉴定其真核表达质粒pEGFP-C1-YAP1,及其磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1 S42A.本研究利用RT-PCR技术,从湖羊背最长肌克隆YAP1基因编码区序列,T-A克隆到pMD 19-T载体中,进行测序.利用酶切和T4连接酶连接方法,将YAP1基因编码区克隆到pEGFP-C 1载体中,构建pEGFP-C 1-YAP1真核表达载体,以真核表达载体为模板,构建磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1 S42A,2种载体均进行PCR、BamHⅠ和XhoⅠ双酶切、BamHⅠ单酶切及测序鉴定.结果克隆出YAP 1基因的全长cDNA序列,获得GenBank登录号JQ 714252,其长度为1712 bp,编码区1212 bp,编码403个氨基酸.重组质粒pEGFP-C1-YAP1经PCR、酶切、测序鉴定,证实YAP1基因CDS区已正确克隆入pEGFP-C1表达载体;经测序鉴定,YAP1第42位丝氨酸成功突变为丙氨酸.本研究成功克隆绵羊YAP1基因全长cDNA序列,并构建了重组真核表达质粒pEGFP-C1-YAP1及磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1 S42A,为进一步研究YAP1蛋白表达及其生物学活性奠定基础.