弓形虫ROP5与ROP18的双基因缺失株构建及表型鉴定

摘要

ROP5与ROP18都是弓形虫重要的毒力因子,本研究旨在构建弓形虫RH株ROP5单基因缺失株,在此基础上构建ROP5与ROP18的双基因缺失株,并研究ROP5基因、ROP18基因的表型功能,为探究两个基因的协同作用奠定基础。首先构建质粒pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5、pROP5::DHFR-D质粒,并将质粒电转至弓形虫RH株速殖子,经息疟定筛选及PCR鉴定;再将质粒pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP18、pROP18::CAT-D电转至鉴定正确的ROP5单基因缺失株(ROP5-KO)速殖子中,经氯霉素筛选并进行PCR鉴定。结果显示:本试验成功获得ROP5-KO株及ROP5与ROP18的双基因缺失株(ROP5/ROP18-KO);两个基因同时缺失可明显降低弓形虫的入侵能力及生长速度;此外,双基因缺失后,弓形虫对小鼠的毒力明显减弱。本研究表明,同时敲除ROP5基因与ROP18基因后,弓形虫毒力显著降低,为进一步探究ROP5与ROP18的协同作用奠定了基础。