自噬对慢性神经病理性疼痛大鼠N -甲基- D -天冬氨酸受体和痛敏的影响

摘要

目的探讨细胞自噬对神经病理性疼痛(NP)大鼠N -甲基- D -天冬氨酸(NMDA)受体及其亚基NR2B和行为学的调控作用。方法将雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术(Sham)组、NP组、自噬抑制剂3 -甲基腺嘌呤(3-MA)预处理组(3-MA+NP组)和自噬激动剂雷帕霉素(Rap)预处理组(Rap+NP组),每组22只。采用结扎坐骨神经的方法制备NP动物模型;Sham组仅暴露坐骨神经但不结扎。两个预处理组分别于术前1 h腹腔注射3-MA 15 mg/kg或Rap 10 mg/kg。各组大鼠于术前及术后1、3、7、14 d检测行为学指标机械缩足反应阈(MWT)和热缩足潜伏期(TWL)。各组于术后1 d、7 d取脊髓组织,透射电镜下观察自噬体形成情况;采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3 -Ⅱ(LC3 -Ⅱ)、Beclin1以及NMDA和NR2B亚基的表达;采用免疫荧光法检测LC3的阳性表达。结果与Sham组比较,NP组大鼠MWT随术后时间延长逐渐下降,TWL逐渐缩短;且1 d时自噬体及脊髓背角LC3 -Ⅱ、Beclin1、NMDA、NR2B蛋白表达和LC3阳性表达即明显增加,并持续至7 d,说明NP可导致痛敏发生并激活自噬活性。给予3-MA预处理可使NP大鼠MWT进一步降低、TWL进一步缩短,自噬体减少,脊髓背角LC3 -Ⅱ、Beclin1表达下降,NMDA、NR2B表达进一步增加,术后1 d与NP组比较差异即有统计学意义〔MWT(g):29.4±2.4比42.5±6.6,TWL(s):7.2±1.0比8.8±1.1,LC3 -Ⅱ/β-actin:0.38±0.03比0.52±0.07,Beclin1/β-actin:0.29±0.06比0.59±0.05,NMDA/β-actin:0.62±0.06比0.50±0.06,NR2B/β-actin:0.57±0.03比0.46±0.03,均P<0.05〕,且免疫荧光染色证实LC3阳性表达明显减少;而给予Rap预处理可使NP大鼠MWT增加、TWL延长,自噬体增加,脊髓背角LC3 -Ⅱ、Beclin1表达增加,NMDA、NR2B表达下降,也于术后1 d与NP组比较即表现出统计学差异〔MWT(g):49.4±4.4比42.5±6.6,TWL(s):10.5±1.2比8.8±1.1,LC3 -Ⅱ/β-actin:0.67±0.09比0.52±0.07,Beclin1/β-actin:0.71±0.08比0.59±0.05,NMDA/β-actin:0.40±0.05比0.50±0.06,NR2B/β-actin:0.34±0.04比0.46±0.03,均P<0.05〕,且免疫荧光显示LC3阳性表达增加,并持续至7 d。说明Rap可以增加自噬的活性,减少痛敏的发生,抑制NMDA受体及其NR2B亚基的表达。结论 NP可以诱发细胞自噬的增加,且通过自噬可以调控NMDA受体及其亚基的表达和痛敏的变化。