蛋白激酶C抑制剂对脂多糖所致大鼠肾微血管内皮细胞损伤的保护作用

摘要

目的探讨蛋白激酶C(PKC)抑制剂Rottlerin对脂多糖(LPS)引起的大鼠肾微血管内皮细胞损伤的保护作用。方法体外培养大鼠肾微血管内皮细胞至3~6代后,按随机数字表法分为3组:空白对照组不给予任何处理;LPS组给予LPS 10 mg/L刺激24 h;PKC抑制剂组在LPS刺激前30 min给予PKC抑制剂Rottlerin 2 μmol/L。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素(IL-1β、IL-8)等炎性因子水平;采用Transwell小室法检测肾单层内皮细胞通透性;采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测细胞PKC、RhoA和血管内皮-钙黏蛋白(VE-cadherin)的表达;激光共聚焦荧光显微镜下观察血管内皮细胞纤维型肌动蛋白(F-actin)的形态及分布。结果与空白对照组相比,LPS组细胞经10 mg/L LPS刺激24 h后,炎性因子水平显著升高〔TNF-α(ng/L):397.3±25.4比46.8±8.9,IL-1β(ng/L):76.7±11.2比12.6±3.2,IL-8(ng/L):574.5±31.4比73.2±9.6,均P<0.05〕,单层内皮细胞通透性显著增高(A值:1.32±0.03比0.36±0.02,P<0.05),PKC和RhoA表达水平明显上调(PKC/β-actin:0.88±0.02比0.61±0.03,RhoA/β-actin:0.96±0.01比0.49±0.03,均P<0.05),VE-cadherin的表达水平明显下调(VE-cadherin/β-actin:0.51±0.01比0.72±0.04,P<0.05),且F-actin分布紊乱,有明显的应力纤维形成。与LPS组相比,PKC抑制剂组细胞炎性因子水平显著降低〔TNF-α(ng/L):127.4±14.6比397.3±25.4,IL-1β(ng/L):43.2±7.8比76.7±11.2,IL-8(ng/L):212.7±18.2比574.5±31.4,均P<0.05〕,单层内皮细胞通透性显著下降(A值:0.81±0.02比1.32±0.03,P<0.05),PKC和RhoA的表达水平明显下调(PKC/β-actin:0.44±0.03比0.88±0.02,RhoA/β-actin:0.63±0.05比0.96±0.01,均P<0.05),VE-cadherin表达水平明显上调(VE-cadherin/β-actin:0.69±0.03比0.51±0.01,P<0.05),且F-actin重构及应力纤维形成明显减轻。结论 PKC抑制剂可以显著减轻LPS诱导的大鼠肾微血管内皮细胞损伤,对血管内皮细胞起保护作用。