巴泰病毒G1189aa-239aa肽段的原核表达、纯化及间接ELISA方法的建立

摘要

本研究旨在获得高纯度巴泰病毒(Batai virus,BATV)G1蛋白强抗原性肽段,并建立一种用于检测BATV羊血清抗体的间接ELISA方法.首先对G1蛋白51个氨基酸编码的189-239位氨基酸强抗原肽段进行密码子优化,基因合成后构建重组表达质粒pET-32a-G1189aa-239aa,转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达.优化表达条件获得大量rHis-G1189aa-239aa肽段,利用镍柱亲和层析方法进行纯化,并用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定.通过Western blotting对rHis-G1189m-239aa肤段进行抗原特异性分析,以rHis-G1189aa-239aa肤段为抗原,羊BATV阳性血清作为抗体,通过方阵滴定优化反应条件,建立BATV间接ELISA检测方法.SDS-PAGE结果显示,rHis-G1189aa-239aa肤段在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在,分子质量为24.5 ku,在0.1 mmol/L的IPTG诱导5 h后rHis-G1189aa-239aa肽段表达量达到峰值.通过镍柱亲和层析纯化后,测得蛋白浓度为0.296 mg/mL.Western blotting结果显示,rHis-G1189aa-239aa肽段特异性较好.以rHis-G1189aa-239aa肤段为抗原建立的间接ELISA方法,通过条件优化确定最佳抗原包被浓度为2.5 μg/mL,血清和二抗稀释度为1 ∶ 60和1 ∶ 10 000.样品D450nm值≥0.367为阳性,D450nm值≤0.319为阴性.该方法与山羊痘病毒和布鲁氏杆菌的阳性血清均无交叉反应,批内和批间的变异系数均＜10％,阳性血清最高可稀释至1 600倍,该方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好的特点.利用本方法对云南地区的120份羊血清样本进行检测,血清阳性率为21.67％.本研究获得了特异性强和纯度较高的rHis-G1189aa-239aa肽段,建立了间接ELISA方法,可应用于羊BATV血清流行病学调查,为疫病防控及致病机制研究奠定基础.