慢病毒介导Occludin过表达影响BVDV感染BALB/c小鼠的研究

摘要

为研究紧密连接蛋白(occludin,OCLN)是否影响牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)在BALB/c小鼠体内的复制。构建慢病毒表达载体pLVML-Myc-bOCLN-linker-GFP-IRES-Puro,连同辅助质粒pSPAX2和pMD2.G共同转染至HEK-293T细胞中,转染48 h后收集OCLN-GFP慢病毒悬液并测定其滴度,同时以pLVML-Myc-Mcs-linker-GFP-IRES-Puro载体包装的慢病毒作为阴性对照(GFP);将4-5周龄BALB/c小鼠随机分为A(0 d)、B(4 d)、C(8 d)、D(10 d)、E(15 d)五组,每组6只,分别注射5×10^(7)IU OCLN-GFP和GFP慢病毒悬液,连续注射两次,间隔48 h,第二次注射后96 h时以1.68×10^(5) TCID_(50)/只BVDV攻毒BALB/c小鼠,分别于攻毒后0、4、8、10、15 d时,解剖小鼠并采集肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠等组织,使用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)和Western blot检测OCLN过表达情况,qRT-PCR检测不同组织中BVDV病毒载量;制作组织病理切片观察各组织病变情况。成功包装OCLN-GFP和GFP慢病毒;慢病毒感染BALB/c小鼠96 h后,OCLN-GFP慢病毒感染后OCLN mRNA和蛋白表达水平显著增加;与GFP慢病毒感染的对照组相比,OCLN-GFP慢病毒感染实验组各组织脏器中BVDV病毒载量从攻毒4 d后出现显著性增加;同时与对照组相比,BVDV攻毒后4 d,实验组小鼠肺脏及肝脏器官最早出现明显病变;BVDV攻毒8 d后,肝脏、脾脏、肺脏等器官病变程度较对照组更加严重。研究表明OCLN过表达能显著性增加BVDV在BALB/c小鼠体内的复制,BVDV感染造成的病理变化更为严重,为阐明OCLN介导BVDV复制等分子机制提供重要依据。