2-萘酸加单氧酶基因及NADH:黄素还原酶基因的克隆与分析

摘要

伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)JT1500对2-萘酸(2-naphthoate)生物降解的关键步骤之一是通过2-萘酸加单氧酶羟化2-萘酸生成1-羟基-2-萘酸(1-hydroxy-2-naphthoate).在已确定2-萘酸加单氧酶基因及其功能的基础上对含有该基因的一个4.8kb长度的基因簇进行了克隆测序.该序列上含有4个可能的阅读框orfB、orfC、orfD、orfA.序列比对发现,orfA序列与Japonicum USDA 110和Ralstonia eutropha HF 39中的加单氧酶基因同源性较高,orfB序列与Bordetlla pertussis TohamaI、Ralstonia solanacearum GMI1000和Bordetella bronchiseptica RB50等菌中的黄素还原酶基因有一定的同源性.酶活分析发现只含基因orfA的重组大肠杆菌SA细胞提取液有很低的加氧活性,含基因orfB的重组子SB细胞提取液没有加氧活性,但在反应体系中同时加入SA和SB的细胞提取液后,其加氧活性显著增强,包含片段orfB+orfA的重组子SB+A在黄素(FMN、FAD)存在的情况下也表现出很强的加氧活性;在厌氧条件下,能检测出SB细胞提取液的黄素还原活性.基于以上信息,认为2-萘酸加单氧酶基因簇含有两个重要的组分:黄素还原酶基因(nmoB)和加单氧酶基因(nmoA).2-萘酸加单氧酶Nmo羟化2-萘酸的过程为先由黄素还原酶(NmoB)在NADH存在的条件下将黄素(FMN、FAD)还原为还原型黄素(FMNH2、FADH2),然后加单氧酶(NmoA)利用还原型黄素和O2羟化底物2-萘酸,生成1-羟基-2-萘酸.NmoB是NmoA的偶联蛋白.