【目的】比较手工法和试剂盒法提取土壤RNA对原核微生物多样性的影响,评价两种方法研究土壤宏转录组的技术偏好性。【方法】针对黑龙江海伦砂质黑壤土、江苏滨海黏心夹砂土、江西鹰潭第四纪红黏土不同母质发育形成的三种水稻土,采用手工和试剂盒法分别获得微生物总RNA,利用高通量测序原核微生物16S r RNA多样性,通过紫外分光和琼脂糖凝胶电泳分析RNA质量,比较手工和试剂盒法提取RNA对水稻土原核微生物群落的影响规律。【结果】三种水稻土中试剂盒提取RNA的纯度皆高于手工法,但RNA提取总量不一致。试剂盒提取黑龙江和江苏水稻土的RNA总量高于手工法,而手工法提取的江西水稻土RNA总量高于试剂盒法。高通量测序发现土壤类型而不是RNA提取方法决定了原核微生物多样性指数和群落结构。3个水稻土共检测到27门和409属,两种RNA提取方法偏好性提取了19门和181属,这些门和属占水稻土微生物总丰度平均值分别为40.4%和44.4%。与手工提取RNA相比,试剂盒法发现11个微生物门的丰度显著偏高(P0.1%且同时存在于三种水稻土),发现其占所有微生物丰度80%强,且48属的变化规律与RNA提取方法无关。例如,手工法提取水稻土好氧甲烷氧化菌的规律为:黑龙江(1.68%)>江西(0.90%)>江苏(0.59%),而试剂盒法也得到一致结果,黑龙江(0.52%)>江西(0.18%)>江苏(0.13%)。【结论】两种RNA提取方法本身的特异偏好性较小。三种水稻土27门409属中,仅有2门7属可能存在方法本身的专一偏好性,即在三种水稻土中,这些微生物均被试剂盒法或手工法特异性偏好提取,占所有原核微生物门和属比例仅为7%和1%左右。此外,针对同一水稻土,手工和试剂盒法提取RNA的总量、纯度、微生物相对丰度明显不同,在原核微生物门和属的分类水平,约70%的门和22%的属的丰度具有统计显著性差异,但两种RNA提http://journals.im.ac.cn/actamicro取方法均能反映优势微生物类群在三种水稻土中的变异规律,土壤类型对原核微生物多样性的影响远大于RNA提取方法本身的偏好性。未来原核微生物宏转录组研究中,应优先考虑科学问题及其实验处理可能导致的微生物组及其转录差异,结合微生物RNA提取特点,最大限度地发挥宏转录组技术优势。
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