基于反转录实时荧光定量PCR的3种标准曲线定量活副溶血性弧菌的差值分析

摘要

【目的】比较分析基于反转录实时荧光定量PCR(Real-time Reverse-Transcriptase PCR,Real-time RTPCR)技术建立的3种标准曲线定量样品中活副溶血性弧菌数量的差异性。【方法】体外转录合成带有目的片段(tlh基因)的RNA标准品,提取纯培养副溶血性弧菌(108CFU/mL)RNA样品,提取接种于虾上副溶血性弧菌(106CFU/g)RNA样品,将3种RNA样品分别反转录得到cDNA,10倍梯度稀释,进行Real-time PCR扩增,建立标准曲线A、B、C(其中标准曲线A和C为本研究首次建立)。用标准曲线A、B、C分别定量6个样品(2个纯培养副溶血性弧菌样品、2个人工污染煮熟南美白对虾样品和2个人工污染生南美白对虾样品)中活副溶血性弧菌数量,并与传统涂布计数法进行比较,分析定量结果的差异性。【结果】3种标准曲线均具有较好的线性关系(R2>0.99);3种标准曲线定量6个样品中活副溶血性弧菌结果均显著(p标准曲线C(18.8%)>标准曲线B(6.9%);标准曲线A对6个样品定量结果与标准曲线B、C定量结果的差值平均值分别为-2.25Lg CFU/mL和-0.75 Lg CFU/mL,相对误差平均值为48.2%和15.9%,标准曲线B与C对6个样品定量结果的差值在(1.47-1.53)Lg CFU/mL之间,相对误差在19.0%-23.8%之间。【结论】标准曲线B可以广泛应用于Real-time RT-PCR准确定量样品中微生物数量。