东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中nce-miR-34537和靶基因PIP5KI的表达谱

摘要

【目的】本研究旨在对前期鉴定到的nce-miR-34537进行表达和序列验证，预测nce-miR-34537的靶基因并明确其分子特性，进而检测nce-miR-34537及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）侵染意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）工蜂过程的表达谱，为进一步探究nce-miR-34537调控东方蜜蜂微孢子虫侵染的功能和作用机制提供基础。【方法】通过Stem-loop-RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-34537的表达和序列。通过生物信息学软件预测nce-miR-34537的靶基因PIP5KI（I型磷脂酰肌醇4-磷酸-5-激酶基因）的理化性质等分子特性和保守基序，并构建基于氨基酸序列的系统进化树。采用RT-qPCR检测nce-miR-34537及其靶基因的表达谱。【结果】nce-miR-34537在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在和表达。nce-miR-34537共靶向PIP5KI等151个基因。PIP5KI蛋白的分子式为C882H1 364N226O251S7，分子量约为19.37 kDa，含160个氨基酸和17个磷酸化位点，但不含信号肽，可同时定位于细胞核、线粒体、细胞质和分泌囊泡。东方蜜蜂微孢子虫的1个PIP5KI （AAJ76＿2700017870）含4个保守基序，另1个PIP5KI（EEQ82436.1）含5个保守基序。东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫（N.apis）和鮟鱇思普雷格孢虫（Spraguea lophii）的PIP5KI在进化树中聚为一支，且东方蜜蜂微孢子虫的PIP5KI （EEQ82436）与蜜蜂微孢子虫的PIP5KI （EQB60549.1）的进化距离最近。相较于接种后1 dpi （day post inoculation）,nce-miR-34537在2 dpi上调表达（P＞0.05），而在4 dpi、6 dpi和8 dpi的表达量均显著下调（P＜0.05）;PIP5KI在2 dpi表达量显著上调（P＜0.05），在4 dpi、6 dpi和8 dpi的表达量均显著下调（P＜0.05）。【结论】nce-miR-34537在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在和表达，东方蜜蜂微孢子虫的PIP5KI（EEQ82436）与蜜蜂微孢子虫的PIP5KI（EQB60549.1）之间亲缘关系最近，nce-miR-34537及其靶基因PIP5KI在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中均表现出上升-下降的表达规律，nce-miR-34537通过正调控PIP5KI表达潜在参与调节侵染过程。