小菜蛾保幼激素受体PxMet-1和PxMet-2的原核表达、纯化及与保幼激素的结合模式

摘要

[目的]昆虫烯虫醋耐性(methoprene-tolerant,Met)蛋白属于bHLH/PAS转录因子家族成员,其与该家族其他成员形成的复合物可介导保幼激素(JH)的信号传导.本研究旨在克隆并表达小菜蛾Plutella xylostella JH受体Met蛋白基因PxMet-1和PxMet-2,纯化其蛋白,分析PxMet-1与PxMet-2与JH的结合模式,为进一步探明PxMet蛋白的功能提供依据.[方法]基于NCBI数据库,克隆验证了小菜蛾PxMet-1和PxMet-2基因的cDNA序列;把这两个基因分别与pGEX-KG载体连接构建表达载体pGEX-KG-PxMet-1 和pGEX-KG-PxMet-2,导入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)使其表达;分别使用HisTrapTM HP与GSTTrapTM HP的5 mL柱对PxMet-1和PxMet-2融合蛋白进行纯化;利用分子对接预测软件分析PxMet-1和PxMet-2蛋白与JH的结合模式.[结果]克隆获得的小菜蛾PxMet-1(GenBank登录号:MK697672)和PxMet-2(GenBank登录号:MT996234)序列与已报道的序列基本一致,仅PxMet-2基因序列存在1个非同义突变,突变位点为第41位氨基酸,由甘氨酸(Gly)突变为丙氨酸(Ala).PxMet-1与PxMet-2蛋白三维结构相似,均包含典型的螺旋-环-螺旋结构.体外原核表达获得具有His和GST双标签的可溶性PxMet融合蛋白,PxMet-1融合蛋白的最优表达条件为0.3 mmol/L的IPTG在16°C下诱导16 h,PxMet-2融合蛋白的为0.1 mmol/L的IPTG 在16°C下诱导16 h.PxMet-1 和PxMet-2分别经150 mmol/L咪唑和20 mmol/L还原型谷胱甘肽洗脱获得高纯度的融合蛋白.SDS-PAGE和Western blot验证PxMet-1和PxMet-2融合蛋白,分别在89.2和106 kD位置获得条带,与推测大小一致.分子对接分析结果显示,PxMet-1和PxMet-2与JH存在相互作用位点,都是在PAS-B保守结构域,和赤拟谷盗Tribolium castaneum Met的JH结合位点相同.[结论]利用pGEX-KG原核表达系统能有效地在体外表达可溶性的PxMet-1和PxMet-2蛋白,PxMet-1和PxMet-2蛋白很可能是小菜蛾JH的分子受体.本研究为进一步解析PxMet蛋白的功能,深入阐明JH调控小菜蛾发育与生殖的分子机理奠定了基础.