松墨天牛OBP基因MaltOBP2和MaltOBP6的克隆、序列分析及组织表达谱和原核表达研究

摘要

[目的]本研究旨在探索松墨天牛Monochamus alternatus Hope在嗅觉识别寄主植物过程中扮演重要角色的气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)的结构及功能.[方法]利用生物信息学方法对得到的MaltOBP2和MaltOBP6基因序列和蛋白结构进行分析,并通过实时荧光定量PCR分析MaltOBP2和MaltOBP6在松墨天牛雄虫不同组织和时空中的表达差异,利用pET32a(+)原核表达载体对MaltOBP2和MaltOBP6进行了诱导蛋白表达.[结果]本研究得到两个松墨天牛气味结合蛋白基因——MaltOBP2(GenBank登录号:KP120891)和MaltOBP6(GenBank登录号:KP120892),ORF长度分别为402 bp和408 bp,翻译的氨基酸序列均含有4个保守的半胱氨酸位点,表明得到的两个OBP基因的编码蛋白均属于Minus-C OBP亚家族;推导的两个OBP蛋白均有6个α螺旋区域,且α螺旋区域在两个蛋白的位置非常相似,但是两个OBP蛋白推测的配体结合位点和位点极性却完全不同.组织表达模式表明,MaltOBP2和MaltOBP6在成虫头部、触角、下颚(唇)须、腹部末端和足中均有表达,表达程度不一,但都在头部显著表达,触角中的表达量相比其他组织中较低或只是持平.发育表达结果表明,MaltOBP2在蛹触角中的表达量最高,而MaltOBP6在幼虫头部的表达量最高.本研究成功构建了原核表达载体pET32a-MaltOBP2和pET32a-MaltOBP6,并进行了OBP蛋白诱导表达,低温(16℃和20℃)条件利于蛋白表达在上清液中,延长诱导表达时间(12 h)可以增加蛋白的表达量.[结论]本研究从松墨天牛体内得到了Minus-C OBP蛋白亚家族的两个基因MaltOBP2和MaltOBP6,通过配体结合位点推测它们具有不同的生理功能;通过组织表达谱结果推测这两个OBP基因在松墨天牛中的功能不仅仅局限于嗅觉识别,或还有味觉感受、化学感受等其他生理功能.本研究结果为两个OBP蛋白的结构和功能研究奠定了基础,为探索松墨天牛的化学感受机制提供了条件.