鸡法氏囊B细胞酵母双杂交cDNA文库的构建

摘要

以酵母穿梭表达质粒pGADT72Ree为载体,采用CLONTECH SMART(switching mechanism at 5'end of RNA transcript)技术,在酵母细胞中构建鸡法氏囊B细胞的酵母双杂交cDNA文库.通过从分离的鸡法氏囊B细胞中提取总RNA,利用经修饰的CDS引物合成cDNA第一链,在链的末端可自动延伸CCC,在反应体系中加入SMART ⅢTM Oligo作为cDNA第二链合成的引物,进行长距离(LD)2PCR合成双链cDNA,后者经CLONTECH CHROMA SPIN+TE24000柱纯化后,与线性质粒pGADT72Rec共转化感受态酵母菌AH109,二者在酵母细胞中利用酵母细胞内具有较高的同源重组酶活性,进行同源重组成环行的有复制活性的文库质粒,在缺亮氨酸(LEU)培养板上筛选出所有克隆,即为鸡法氏囊B细胞的酵母双杂交cDNA文库.结果:共获得2.2×106转化子,文库扩增后,插入cDNA长度在0.5～3 kb.研究结论表明可在酵母细胞中利用CLONTECH SMART技术成功构建鸡法氏囊B细胞的酵母双杂交cDNA文库.