香烟提取物对血栓调节蛋白的影响暨伐尼克兰对氯吡格雷抗血小板作用影响的研究

摘要

吸烟是心血管疾病的独立危险因素，可导致内皮功能紊乱，炎症反应增加，血管内血栓形成，易诱发急性心血管事件的发生。其中针对吸烟导致血栓形成机制的研究虽有报道，但是目前尚未阐明。血栓调节蛋白（Thrombomodulin,TM）是内皮细胞表面的一种糖蛋白，作为一个重要的抗凝辅助因子，它与凝血酶以1：1结合，通过激活蛋白C起到抗凝作用。而TM与凝血酶的结合不仅取决于TM量的表达，而且也取决于其与凝血酶在单分子水平的亲和力。目前针对吸烟对TM表达量的研究虽有少量报道，但是研究结果显示吸烟对可溶性TM表达的影响不一致；另外，对于TM与凝血酶在单分子水平的相互作用的研究未见报道。吸烟是否通过影响TM量的表达或者影响其与凝血酶的结合力这条途径导致血管内血栓形成不清楚。
　　研究表明，支架术后患者持续吸烟会增加支架内再狭窄率及心血管事件的发生，然而戒烟可以使冠心病患者的死亡率下降36％。由于吸烟是一种成瘾性疾病，戒除后病人会出现焦虑、烦躁等戒断症状，同时机体里的尼古丁水平下降、从而导致多巴胺水平下降，可能诱发心血管事件发生，而其仅凭个人毅力戒烟成功率很低，故需借助戒烟药物缓解戒断症状，提高戒断率，从而减少心血管事件的发生。伐尼克兰是一种尼古丁乙酰胆碱受体部分激动剂，目前已被全球70多个国家批准为戒烟辅助药。支架术后病人常规服用氯吡格雷抗血小板治疗，防止支架内血栓形成。故有可能支架术后的病人同时服用戒烟药物和氯吡格雷。但是两者间是否有药物相互作用，目前没有循证医学证据。
　　第一部分香烟提取物对血管内皮细胞表面血栓调节蛋白表达的影响
　　目的：研究不同条件下的香烟提取物（CigaretteSmokeExtract,CSE）对人脐静脉内皮细胞（HumanUmbilicalVeinEndothelialCell,HUVEC）表面TM量的表达，从而探讨吸烟导致血管内血栓形成的可能机制。
　　方法：参照Nakamura方法制备CSE在30min内用于实验。以0.1%I型胶原酶37℃消化15-20min人脐静脉内皮，分离获得的原代HUVEC用低血清内皮细胞专用培养基培养，37℃、5%CO2孵箱内培养至融合后传代；用VIII因子相关抗原鉴定HUVEC，将第2-3代细胞用于实验。将第3代HUVEC接种至6孔板，用不同浓度CSE（0、0.5%、1%、2.5%、5%）同一时间（6小时）及同一浓度5%CSE不同时间（0h、6h、10h、12h、24h）孵育、收集细胞，分别采用流式细胞仪计数和实时荧光定量PCR（Real-timePCR）方法检测TM的蛋白量和mRNA水平的表达。
　　结果：（1）与对照组相比，6小时不同浓度（0.5%、1%、2.5%、5%）CSE降低了HUVEC表面TM在mRNA和蛋白水平的表达（P＜0.01）；mRNA水平组间比较除了0.5%CSE和1%CSE组没有统计学差异，其它两两浓度比较均有显著差异（P＜0.001）；蛋白水平组间比较，5%CSE组与0.5%CSE组有统计学差异（P＜0.05）,其它浓度组间比较无统计学差异。
　　（2）与对照组比较，同一浓度(5%)CSE不同时间（6h、10h、12h、24h、）明显降低了HUVEC表面TM在mRNA和蛋白水平的表达（P＜0.01)；并且在12小时以内TM的表达随着时间延长逐渐降低，至24小时以后TM表达不再继续下降。
　　结论：CSE可下调HUVEC表面TM的表达，并呈量-效关系。12小时以内呈时-效关系。
　　第二部分香烟提取物对血栓调节蛋白与凝血酶结合力的影响
　　目的：利用单分子力谱法检测CSE处理后的TM与凝血酶单分子水平结合力，从而探讨吸烟导致血管内血栓形成的可能机制。
　　方法：1.从HUVEC中提取总RNA，反转录为cDNA，构建TM-GFP质粒并转染至COS-7细胞分组测力：（1）空白质粒对照组（GFP-thrgroup）（2）TM-GFP对照组（TM-thrgroup）（3）5%CSE孵育空白质粒细胞组（CSE-GFP-thrgroup）（4）5%CSE孵育TM-GFP细胞1小时组（CSE-TM-thr1hgroup）（5）5%CSE孵育TM-GFP细胞6小时组（CSE-TM-thr6hgroup）每组测力后均加入鼠抗人特异单克隆抗TM抗体行封闭阻断实验。
　　在2.0±0.5×103pN/s的加载速率范围下，对荧光显微镜下观察各组细胞所获得的TM荧光融合蛋白聚集区，用凝血酶修饰的原子力显微镜(atomicforcemicroscope,AFM)探针反复在细胞表面下压-回拉，随机获得力-距离曲线，统计得出针尖和细胞间亲和力的高斯分布及成键几率。
　　2.用流式细胞仪计数法检测5%CSE孵育TM-GFP转染后的COS-7细胞1h、6h的荧光强度。
　　结果：（1）TM-Thr对照组高斯拟合的结合力：TM与凝血酶最可几的相互作用力的大小为60.90311±0.81723pN，TM与凝血酶的AFM成键几率为22.58±3.95%，抗体阻断后成键几率为2.58±2.0%。
　　（2）与TM-Thrgroup比较，GFP-Thrgroup，CSE-TM-Thr1hgroup，CSE-TM-Thr6hgroup，CSE-GFP-Thrgroup四组AFM成键几率明显减低，P<0.0001；但四组间两两比较无统计学差异。
　　（3）用流式细胞仪计数法检测5%CSE孵育TM-GFP转染后的COS-7细胞1h、6h的荧光强度表达结果：和对照组比较，5%CSE组1h、6h荧光强度没有统计学差异。
　　结论：在CSE孵育COS-7细胞1小时、6小时不影响TM荧光量的表达下，CSE可明显减少TM与凝血酶的成键几率。结合第一部分研究提示：吸烟可能通过下调TM量的表达并减少其与凝血酶结合几率，抑制了TM的抗凝作用，从而导致血管内血栓形成。
　　第三部分伐尼克兰对氯吡格雷抗血小板作用影响的研究
　　目的：通过观察戒烟药物伐尼克兰对氯吡格雷抗血小板作用的影响，企图为戒烟药物和抗血小板联合用药的安全性方面提供循证医学证据。
　　方法：连续选取自2010年7月至2012年3月在武警总医院心内科住院的择期行经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneouscoronaryintervention,PCI）术的冠心病吸烟患者136例，签署知情同意书后随机分为两组：常规治疗组和常规治疗加伐尼克兰组。所有入选病人均于术前给予阿司匹林100mg/d,氯吡格雷300mg/d，随后给予75mg/d服用第三天随机给与或不给与伐尼克兰治疗，两组均提供戒烟方法和咨询随访。记录所有病人的冠心病危险因素、合并疾病及合并用药等情况。服用氯吡格雷前、伐尼克兰前抽血化验血生化（血糖、血脂、肝肾功、尿酸、心肌标志物等）、血小板聚集率、血小板反应指数(plateletreactivityindex,PRI)及服用后第7天、14天抽血化验血肌酐、心肌标志物、血小板聚集率、PRI，记录不良事件和严重不良事件。
　　结果：1.两组基线水平比较无差别。
　　2.常规治疗组和伐尼克兰组在服用伐尼克兰2周的血小板聚集率及PRI比较
　　（1）PRI%:服用氯吡格雷前80.08±5.60vs79.94±5.18，P=0.893；服用伐尼克兰前55.21±14.87vs53.74±14.47，P=0.591；服用伐尼克兰1周41.87±17.05vs40.16±15.81，P=0.579；服用伐尼克兰2周43.01±13.59vs42.18±11.27，P=0.723。两组PRI均随着时间的延长明显降低，具有统计学差异（P=0.000）。
　　（2）血小板聚集率：
　　入院时：服用氯吡格雷前44.13±7.89vs43.67±7.31，P=0.744；服用伐尼克兰前26.53±11.27vs24.92±10.75，P=0.433；服用伐尼克兰1周21.42±10.56vs20.45±9.75，P=0.612；服用伐尼克兰2周23.61±10.09vs23.34±10.64，P=0.893。两组血小板聚集率均随着时间的延长明显降低，具有统计学差异（P=0.000）。
　　3.（1）2周两组肾功能比较
　　常规治疗组和伐尼克兰组的肾小球滤过率（estimatedglomerularfiltrationrate，eGFR）在各时间点均无统计学差异。
　　（2）不良事件和严重不良事件情况
　　伐尼克兰组的不良事件较常规治疗组略有增加，但两组无统计学差异；严重不良事件：两组均发生围手术期心梗5例，并未发生支架内血栓等其它严重不良事件。
　　结论：短期观察伐尼克兰与氯吡格雷合用不影响后者的抗血小板作用，是安全的。
　　总结：基础研究提示：通过下调TM量的表达及影响其与凝血酶结合力，可能是吸烟导致血管内血栓形成的机制之一。临床研究提示：冠心病行PCI术的吸烟患者服用戒烟药伐尼克兰不影响氯吡格雷的抗血小板作用，不需调整用量。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 香烟提取物对血管内皮细胞表面血栓调节蛋白表达的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 香烟提取物对血栓调节蛋白与凝血酶结合力的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 伐尼克兰对氯吡格雷抗血小板作用的影响

引言

研究对象和方法

结果

讨论

结论

参考文献

文献综述一

参考文献

文献综述二

参考文献

攻读学位期间发表文章情况

致谢