RAMP1基因启动子区DNA甲基化状态及MicroRNA与偏头痛相关性

摘要

目的:偏头痛是一种常见神经系统疾病，临床主要表现为反复发作的单侧中重度搏动性头痛，伴恶心、呕吐、畏光、畏声，活动加重头痛，严重影响患者生活质量、工作能力，被WHO列为第6位失能性疾病。由于复杂的发病机制仍不十分清楚，偏头痛迄今依然缺乏可用于临床的标志物，诊断高度依赖临床症状，严重困扰患病风险评估、临床鉴别诊断，以及预后判断。目前推测表观调节机制可能参与偏头痛的发病过程，如DNA甲基化和miRNA的异常表达，但临床研究很少。大量研究显示降钙素基因相关肽(CGRP)及其受体活性修饰蛋白1(RAMP1)与偏头痛发病密切相关，然而基因多态性研究并未发现与偏头痛相关。本研究拟从临床角度，探索外周血RAMP1启动子区DNA甲基化水平、循环miRNA(miR-188-5p与miR-382-5p)及CGRP差异性表达是否与偏头痛有关，能否作为偏头痛新的临床标志物。
　　方法:以偏头痛患者及年龄、性别匹配的健康对照作为研究对象，抽取静脉血，分离血清，提取外周血细胞DNA和RNA，以及血清miRNA;亚硫酸盐处理DNA，采用Sequenom公司的Mass ARRAY系统对RAMP1基因启动子区CpG岛进行甲基化定量分析;血清miRNA逆转录后，实时定量PCR检测miR-188-5P和miR-382-5p相对表达;采用实时定量PCR检测外周血CGRP mRNA的表达。分析外周血RAMP1基因启动子区CpG岛甲基化、CGRP mRNA，以及血清miR-188-5P和miR-382-5p和偏头痛相关性。
　　结果:①偏头痛组RAMP1启动子区平均甲基化水平较健康对照组有降低趋势，8.41％±1.92％vs.9.90％±3.88％，p=0.197;②有偏头痛家族史的患者在（+25，+27，+31，相对于转录起始点）CpG单位的甲基化水平显著高于无偏头痛家族史的患者（13.92％±5.97％vs.8.77％±6.61％，p=0.034）;③女性患者在(+89，+94，+96) CpG单位的甲基化水平显著低于健康女性(2.18％±1.91％ vs.5.85％±5.41％，p=0.02)，而在男性患者和男性对照中并没有类似差异;该位点甲基化水平低于3.50％的女性，其罹患偏头痛的风险高于甲基化水平大于3.50％的女性(OR:7.313;95％Cl:1.439-37.164);④有偏头痛家族史患者血清miR-188-5p相对表达量下降4.2倍(p=0.106)，发作期miR-188-5p较非发作期相对表达量下降5.54倍(p=0.132)，但未达到显著统计学差异;⑤miR-382-5p的相对表达量在偏头痛和对照组之间未见明显差异;⑥外周血CGRP mRNA未见差异性表达。
　　结论:①本研究提示RAMP1基因启动子区DNA甲基化可能参与偏头痛发病，在偏头痛患者中平均甲基化水平有降低趋势，2个CpG单位甲基化水平分别与阳性偏头痛家族史和女性偏头痛相关，其中(+89，+94，+96) CpG单位甲基化可能与女性罹患偏头痛的风险有关;②血清miR-188-5p可能与偏头痛阳性家族史和偏头痛发作有关;③血清miR-382-5p水平和外周血CGRP mRNA表达与偏头痛关联性不密切。上述发现仍需进一步扩大样本量验证，其潜在的分子机制仍需阐明。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

第一部分 RAMP1基因启动子区甲基化状态与偏头痛相关性

前言

1 方法

1．1 研究对象

1．2 试验所用的主要试剂和仪器

1．3 血样采集和DNA提取

1．4 RAMP1基因启动子区CpG岛分析

1．5 甲基化定量分析

1．6 统计学处理

2 结果

2．1 入组患者及健康对照基本资料

2．2 甲基化模式

3 讨论

第二部分 循环miR-188-5p和miR-382-5p与偏头痛相关性

前言

1 方法

1．1 研究对象

1．2 试验所用的主要试剂和仪器

1．3 标本采集

1．4 靶基因为RAMP1的miRNA生物信息学预测

1．5 血清miRNA提取

1．6 miRNA逆转录

1．7 qRT-PCR

1．8 统计学分析

2 结果

2．1 入组患者及健康对照临床资料

2．2 miR188-5p的变化

2．3 miR382-5p的变化

3 讨论

第三部分 外周血CGRP表达与偏头痛

前言

1 方法

1．1 研究对象

1．2 主要试剂和仪器

1．3 标本采集与处理

1．4 总RNA的抽提

1．5 RNA逆转录合成cDNA

1．6 qRT-PCR

1．7 统计学分析

2 结果

2．1 入组患者及健康对照组基本特征

2．2 CGRP mRNA的表达变化

3 讨论

结论

参考文献

文献综述一 CGRP与偏头痛

文献综述二 偏头痛的临床标志物研究现状

攻读学位期间发表文章情况

致谢